متغیرهای وابسته به نمونه در آزمایش

متغیرهای وابسته به نمونه در آزمایش، متغییر هایی هستند که جدا از روش، تجهیزات و مابقی مواردی که در نتایج آزمایش تاثیر می گذارند، می توانند نتایج حاصل شده را به راحتی تغییر دهند. لذا توجه به این عوامل در حین پذیرش، نمونه گیری و انجام آزمایش ها بسیار پر اهمیت است.

متغیرهای وابسته به نمونه در آزمایش  قبل از نمونه گیری و اثرات آن در نتایج آزمایش:

در آماده سازی بیمار برای فلبوتومی(خونگیری)، باید مراقب بود که عوامل فیزیولوژیک مرتبط با فعالیت هایی که ممکن است بر تعیین های آزمایشگاهی تأثیر بگذارند، به حداقل برسد. اینها شامل تغییرات روزانه، ورزش، روزه داری، رژیم غذایی، مصرف اتانول، استعمال دخانیات، مصرف مواد مخدر و وضعیت بدنی است.

عوامل فیزیولوژیکی موثر در تداخلات قبل از نمونه گیری:

تغییرات آنالیت ها در طول روز:

این ممکن است هنگام آزمایش هورمون‌ها، آهن، اسید فسفاتاز و دفع ادراری اکثر الکترولیت‌ها مانند سدیم، پتاسیم و فسفات مشاهده شود. جدول زیر آزمایش هایی را نشان می دهد که تحت تأثیر تغییرات روزانه، وضعیت بدنی و استرس قرار دارند.

ورزش:

فعالیت بدنی اثرات گذرا و درازمدت بر تعیین‌های آزمایشگاهی دارد. تغییرات گذرا ممکن است شامل کاهش اولیه و به دنبال آن افزایش اسیدهای چرب آزاد باشد و لاکتات ممکن است تا 300 درصد افزایش یابد. ورزش ممکن است کراتین فسفوکیناز (CK)، آسپارتات آمینوترانسفراز (AST) و لاکتات دهیدروژناز (LD) را افزایش دهد و ممکن است انعقاد، فیبرینولیز و پلاکت ها را فعال کند. این تغییرات مربوط به افزایش فعالیت های متابولیک برای اهداف انرژی است و معمولاً بلافاصله پس از توقف ورزش به سطح قبل از تمرین باز می گردد.

اثرات طولانی مدت ورزش ممکن است مقادیر CK، آلدولاز، AST و LD را افزایش دهد. ورزش هوازی مزمن با افزایش کمتری در غلظت پلاسمایی آنزیم های عضلانی مانند CK، AST، آلانین آمینوترانسفراز (ALT) و LD همراه است. کاهش سطح گنادوتروپین سرم و غلظت استروئیدهای جنسی در ورزشکاران مسافت طولانی مشاهده می شود، در حالی که سطح پرولاکتین افزایش می یابد.

رژیم غذایی:

رژیم غذایی یک فرد می تواند بر نتایج تست های آزمایشگاهی تأثیر زیادی بگذارد. اثر گذرا است و به راحتی قابل کنترل است.

گلوکز و تری گلیسیرید جذب شده از غذا پس از خوردن غذا افزایش می یابد. پس از 48 ساعت ناشتا، غلظت بیلی روبین سرم ممکن است افزایش یابد. ناشتا بودن به مدت 72 ساعت سطح گلوکز پلاسما را در زنان سالم به 45 میلی گرم در دسی لیتر (5/2 میلی مول در لیتر) کاهش می دهد، در حالی که مردان افزایش تری گلیسیرید، گلیسرول و اسیدهای چرب آزاد را نشان می دهند، بدون اینکه تغییر قابل توجهی در کلسترول پلاسما ایجاد شود. هنگام تعیین ترکیبات خونی مانند گلوکز، تری گلیسیرید، کلسترول و الکترولیت ها، جمع آوری باید در حالت پایه انجام شود.

خوردن یک وعده غذایی، بسته به محتوای چربی، ممکن است پتاسیم پلاسما، تری گلیسیرید، آلکالین فسفاتاز و 5-هیدروکسی اندول استیک اسید (5HIAA) را افزایش دهد. آزمایش‌های خون مخفی مدفوع، که هم(Heme) را شناسایی می‌کند، تحت تأثیر مصرف گوشت، ماهی، آهن و ترب کوهی قرار می‌گیرد که منبع پراکسیداز است و باعث واکنش خون مخفی مثبت کاذب می‌شود. علاوه بر این، مصرف آنتی‌اکسیدهای حاوی بیسموت مانند پپتو بیسمول نیز نتایج مثبت کاذب را به همراه دارد.

تغییرات فیزیولوژیک ممکن است شامل هیپرشیلومیکرونمی باشد، در نتیجه کدورت سرم یا پلاسما را افزایش می دهد و به طور بالقوه با قرائت اتوآنالیزر، تداخل می کند. برخی غذاها یا رژیم های غذایی ممکن است بر ترکیبات سرم یا ادرار تأثیر بگذارد.

گزارش شده است که رژیم های گیاهخواری طولانی مدت باعث کاهش غلظت لیپوپروتئین های با چگالی کم (LDL)، لیپوپروتئین های با چگالی بسیار کم (VLDL)، کل چربی ها، فسفولیپیدها، کلسترول و تری گلیسیرید می شود. کمبود ویتامین B12 نیز می تواند رخ دهد مگر اینکه مکمل ها مصرف شوند.

یک رژیم غذایی سرشار از گوشت یا سایر غذاهای غنی از پروتئین ممکن است سطح سرمی اوره، آمونیاک و اورات را افزایش دهد. رژیم‌های پر پروتئین و کم کربوهیدرات، کتون‌های موجود در ادرار را تا حد زیادی افزایش می‌دهند و نیتروژن اوره خون (BUN) را افزایش می‌دهند.

غذاهایی با نسبت اسیدهای چرب غیراشباع به اشباع بالا ممکن است کاهش کلسترول سرم را نشان دهند، در حالی که رژیم غذایی غنی از پورین مقدار اورات را افزایش می دهد. غذاهایی مانند موز، آناناس، گوجه فرنگی و آووکادو سرشار از سروتونین هستند. نوشیدنی‌های غنی از کافئین اسیدهای چرب آزاد پلاسما را افزایش می‌دهند و باعث آزاد شدن کاتکولامین از بصل‌آدرنال و بافت مغز می‌شوند.

مصرف اتانول باعث افزایش غلظت لاکتات، اورات و تری گلیسیرید پلاسما می شود. افزایش کلسترول لیپوپروتئین با چگالی بالا (HDL)، γ-گلوتامیل ترانسفراز (GGT)، اورات و حجم متوسط ​​بدن (MCV) با سوء مصرف مزمن الکل مرتبط است. غلظت سرمی کلسترول، تری گلیسیرید و لیپوپروتئین های apoB با چاقی در ارتباط است. فعالیت LDH سرم، تولید کورتیزول و گلوکز در چاقی افزایش می یابد. غلظت انسولین پلاسما نیز افزایش می یابد، اما تحمل گلوکز مختل می شود. در مردان چاق، غلظت تستوسترون کاهش می یابد.

فشار:

استرس های روحی و جسمی باعث تولید هورمون آدرنوکورتیکوتروپیک (ACTH)، کورتیزول و کاتکول آمین ها می شود. گزارش شده است که کلسترول تام با استرس خفیف افزایش می یابد و کلسترول HDL تا 15 درصد کاهش می یابد. هیپرونتیلاسیون بر تعادل اسید و باز تأثیر می گذارد و تعداد لکوسیت ها، لاکتات سرم یا اسیدهای چرب آزاد را افزایش می دهد.

وضعیت بدن:

وضعیت بدن بیمار در حین فلبوتومی می تواند بر روی نتایج مختلف آزمایشگاهی تأثیر بگذارد. وضعیت عمودی فشار هیدرواستاتیک را افزایش می دهد و باعث کاهش حجم پلاسما و افزایش غلظت پروتئین ها می شود.

سطح آلبومین و کلسیم ممکن است با تغییر وضعیت فرد از حالت خوابیده به پشت به حالت ایستاده افزایش یابد. عناصری که تحت تأثیر تغییرات وضعیت قرار می گیرند عبارتند از آلبومین، پروتئین کل، آنزیم ها، کلسیم، بیلی روبین، کلسترول، تری گلیسیرید و داروهای متصل به پروتئین ها.

استفاده نادرست از تورنیکه و باز و بسته کردن مشت می تواند منجر به نتایج آزمایش اشتباه شود. استفاده از تورنیکه برای جمع آوری خون برای تعیین غلظت لاکتات ممکن است منجر به افزایش کاذب مقادیر شود. استفاده طولانی مدت از تورنیکه همچنین ممکن است باعث افزایش آنزیم‌ها، پروتئین‌ها و مواد متصل به پروتئین (از جمله کلسترول، کلسیم و تری گلیسیرید) سرم شود که نتیجه‌ی غلظت خون در هنگام خروج آب پلاسما از ورید به دلیل فشار برگشتی است.

پس از استراحت در بستر در بیمارستان، هموگلوبین (Hb) بیمار می تواند از مقدار پذیرش اولیه به اندازه ای کاهش یابد که پزشک را به اشتباه به خونریزی داخلی یا همولیز مشکوک کند. این اثر را می توان با تزریق داخل وریدی مایع تقویت کرد. به بیماران توصیه می شود 24 ساعت قبل از گرفتن خون برای آزمایش های آزمایشگاهی از تغییر در رژیم غذایی، مصرف الکل و ورزش های شدید خودداری کنند.

سن:

سن بیمار بر ترکیبات سرمی تاثیر دارد. یانگ چهار گروه سنی را تعریف می کند: نوزادان، دوران کودکی تا بلوغ، بزرگسالان و بزرگسالان مسن.

در نوزادان، بیشتر Hb Hb F است، نه Hb A، اما در بزرگسالان برعکس است. غلظت بیلی روبین پس از تولد افزایش می یابد و در حدود 5 روز به اوج خود می رسد. در موارد بیماری همولیتیک جنین و نوزاد (HDFN)، سطح بیلی روبین همچنان در حال افزایش است. این اغلب باعث ایجاد مشکل در تشخیص زردی فیزیولوژیک و HDFN می شود.

نوزادان به دلیل ذخیره گلیکوژن پایین، سطح گلوکز کمتری نسبت به بزرگسالان دارند. با رشد اسکلتی و رشد عضلات، سطح سرمی آلکالین فسفاتاز و کراتینین نیز به ترتیب افزایش می یابد. سطح اسید اوریک بالا که در یک نوزاد تازه متولد شده مشاهده می شود در 10 سال اول زندگی کاهش می یابد و سپس به خصوص در پسران تا سن 16 سالگی افزایش می یابد.

اکثر ترکیبات سرم در طول زندگی بزرگسالی تا شروع یائسگی در زنان و میانسالی در مردان ثابت می مانند. افزایش حدود 2 میلی گرم در دسی لیتر (0/05 میلی مول در لیتر) در سال در کلسترول تام و 2 میلی گرم در دسی لیتر (0/02 میلی مول در لیتر) در سال در تری گلیسیرید تا اواسط سالی گزارش شده است. افزایش کلسترول در زنان یائسه به کاهش سطح استروژن نسبت داده شده است.

سطح اسید اوریک در مردان در 20 سالگی به اوج خود می رسد اما در زنان تا میانسالی به اوج خود نمی رسد. سالمندان تری یدوتیرونین(T3)، هورمون پارا تیروئید(PTH)، آلدوسترون و کورتیزول کمتر ترشح می کنند. پس از 50 سالگی، مردان کاهش در میزان ترشح و غلظت تستوسترون را تجربه می کنند و زنان افزایش گنادوتروپین های هیپوفیز، به ویژه هورمون محرک فولیکول (FSH) دارند.

جنسیت:

پس از بلوغ، مردان معمولاً سطح آلکالین فسفاتاز، آمینوترانسفراز، کراتین کیناز و آلدولاز بالاتری نسبت به زنان دارند. این به دلیل توده عضلانی بزرگتر مردان است.

زنان سطوح پایین تری از منیزیم، کلسیم، آلبومین، Hb، آهن سرم و فریتین دارند. از دست دادن خون قاعدگی به کاهش مقدار آهن کمک می کند.

افراد ترنس‌، هورمون‌درمانی با استروژن یا تستوسترون دریافت می‌کنند تا هویت جنسیتی را تأیید کنند که با جنسیت تولدشان ناسازگار است، بنابراین، نیاز به نظارت برای آسیب احتمالی اندام‌ها دارند.

تفسیر آزمایش آزمایشگاهی در این افراد لزوماً از محدوده مرجع جنسیت تغییر یافته تبعیت نمی کند. به عنوان مثال، سطح کراتینین معمولاً در مردان به دلیل توده عضلانی بزرگتر بالاتر است، که با درمان استروژن تغییر نمی کند. بنابراین زنان تراجنسیتی (مذکر متولد شده) نباید بر اساس محدوده مرجع زن ارزیابی شوند. محدوده مرجع هماتولوژی برای افرادی که درمان با استروژن یا تستوسترون در افراد تراجنسیتی دریافت می‌کنند، از نظر بالینی مشابه افراد سیسجندر است.

از آنجایی که پاسخ سایر تست‌های آزمایشگاهی رایج به هورمون‌درمانی هنوز به خوبی در مورد تعداد زیادی از بیماران ثابت نشده است، ممکن است لازم باشد آزمایشگاه‌ها این محدوده‌ها را به صورت تجربی در میان بیماران گروهی که هورمون درمانی پایدار را به دست آورده‌اند، تعیین کنند.

سیستم های اطلاعات آزمایشگاهی در حال حاضر از یک انتخاب باینری برای ورود جنسیت استفاده می کنند: مرد یا زن. به منظور به طور کامل درمان هورمونی و همچنین جنسیت هنگام تولد، این انتخاب دوتایی ممکن است بسط داده شود تا گزینه‌های مرد به زن و زن به مرد را نیز در بر بگیرد تا دقیق‌ترین محدوده مرجع را اعمال کند.

عوامل محیطی موثر در تداخلات قبل از نمونه گیری:

سیگار کشیدن :

افراد سیگاری دارای سطوح کربوکسی هموگلوبین خون، کاتکول آمین های پلاسما و کورتیزول سرم بالاتری هستند. تغییرات در این هورمون ها اغلب منجر به کاهش تعداد ائوزینوفیل ها می شود، در حالی که نوتروفیل ها، مونوسیت ها و اسیدهای چرب آزاد پلاسما افزایش می یابند.

اثرات مزمن سیگار منجر به افزایش غلظت هموگلوبین، تعداد گلبول‌های قرمز خون، MCV و لکوسیت‌ها (گلبول‌های سفید خون [WBC]) می‌شود. افزایش سطح پلاسمایی لاکتات، انسولین، اپی نفرین و هورمون رشد و ترشح ادراری 5HIAA نیز دیده می شود.

سطوح ویتامین B12 ممکن است به میزان قابل توجهی کاهش یابد و گزارش شده است که با سطوح تیوسیانات سرم نسبت معکوس دارد. سیگار همچنین بر پاسخ ایمنی بدن تأثیر می گذارد. ایمونوگلوبولینIgA، IgG و IgM در افراد سیگاری کمتر است و سطح IgE بالاتر است. کاهش تعداد و تحرک اسپرم و افزایش مورفولوژی غیرطبیعی در مردان سیگاری در مقایسه با افراد غیرسیگاری گزارش شده است.

اثرات داروها:

روش های آنالیزی که مبتنی بر واکنش های کاهش اکسیداسیون هستند ممکن است تحت تاثیر مثبت یا منفی مواد مصرف شده مانند اسید اسکوربیک (ویتامین C) قرار گیرند. این تداخل در آزمایش شیمیایی سرم بر روی آنالایزرهای خودکار مشاهده می شود و همچنین می تواند در آزمایش ادرار برای گلوکز رخ ​​دهد (تداخل مثبت برای روش احیای ماده؛ تداخل منفی با روش آنزیمی).

در آزمایش مدفوع برای خون مخفی، پراکسیدازهای موجود در گوشت (میوگلوبین) یا سبزیجات (ترب کوهی) در رژیم غذایی می‌تواند نتایج مثبت کاذب را با روش‌های مبتنی بر گایاک، و همچنین ید یا کلر موضعی که به عنوان ضدعفونی‌کننده استفاده می‌شود، به همراه داشته باشد.

داروها می توانند واکنش های پیش بینی نشده ای با معرف های در نظر گرفته شده برای آزمایش های شیمیایی خاص داشته باشند. فهرست داروهای تداخل کننده بالقوه بسیار طولانی است و برخی از روش ها برای یک آنالیت خاص ممکن است به شدت تحت تأثیر قرار گیرند، در حالی که روش های دیگر ممکن است اصلاً تحت تأثیر قرار نگیرند.

در موارد مشکوک به دخالت این تداخل ها به مواردی تقسیم می شوند که اثرات آنها مستقیماً در آزمایش در شرایط آزمایشگاهی آشکار می شود و آنهایی که به دلیل اعمال دارو در داخل بدن است، که به موجب آن عملکردهای فیزیولوژیکی تغییر می کنند (به عنوان مثال، طولانی شدن زمان پروترومبین [PT] با کومادین، کاهش پتاسیم در خون با مقداری کمی از دیورتیک ها)

در مبحث تداخلات دارویی به تفصیل به این موضوع پرداخته ده است.

مطلب پیشنهادی: تداخلات دارویی در آزمایش ها

رنگ ها:

رنگ‌هایی مانند متیلن بلو و پیریدیوم مدت‌هاست که مشخص شده‌اند که از طریق ادرار دفع می‌شوند و بنابراین پتانسیل تداخل با تست‌های رنگ‌سنجی را دارند.

اسید اسکوربیک یک اثر اضافی برای کاهش مواد واسطه در واکنش‌های نواری ادرار برای ترکیباتی مانند گلوکز دارد و در نتیجه باعث کاهش کاذب مقادیر می‌شود. برعکس، اسید اسکوربیک به شدت به آزمایش‌های احیای مواد کمک می‌کند، که همچنین برای ارزیابی غلظت گلوکز ادرار و همچنین سایر ناهنجاری‌های متابولیک استفاده می‌شود.

محتمل ترین داروهایی که تداخل دارند، عوامل ضد باکتریایی، داروهای روانگردان و مواد حاجب هستند. ادرار نمونه ای است که بیشترین احتمال اثر را دارد.

اتانول:

مشخص شده است که اتانول باعث کاهش قابل توجهی در اندازه گیری ALT (تا 50 درصد) و LDH (تا 70 درصد) در سرم می شود که غلظت های مختلف اتانول به عنوان نماینده سطوح معمول الکل خون به آنها اضافه شده است. اندازه گیری مستقیم بیلی روبین نیز حدود 25 درصد و اوره بیش از 10 درصد کاهش می یابد.

این یافته‌ها برای یک شرکت تولیدکننده کیت مشاهده شد، اما به خوبی می‌تواند یک پدیده کلی باشد که به دلیل استفاده استاندارد از این تست‌های آزمایشگاهی در ارزیابی بیمارانی که برای مراقبت‌های اورژانسی مراجعه می‌کنند، اهمیت بالینی دارد.

متغیرهای وابسته به نمونه در آزمایش، در حین نمونه گیری و اثرات آن در نتایج آزمایش:

در مواردی، هنگامی که مشکلی در یافتن ورید برای فلبوتومی وجود دارد، نمونه ممکن است در نتیجه نیروهای محض وارد بر گلبول های قرمز همولیز شود. همولیز همچنین می‌تواند با استفاده از سوزن خیلی کوچک، کشیدن سریع پیستون سرنگ، تخلیه شدید خون به داخل لوله، تکان دادن یا مخلوط کردن شدید لوله‌ها، یا انجام خون‌گیری قبل از خشک شدن الکل ایجاد شود.

لوله های جمع آوری خون با حجم کوچکتر و خلاء کمتر می توانند همولیز را کاهش دهند. زمانی که لایه سرم یا پلاسما صورتی رنگ باشد، همولیز وجود دارد. همولیز می تواند به طور کاذب ترکیبات خونی مانند پتاسیم، منیزیم، آهن، LD، فسفر، آمونیوم و پروتئین کل را افزایش دهد. جدول زیر تغییرات در غلظت (یا فعالیت) سرمی ترکیبات انتخاب شده ناشی از لیز گلبول های قرمز را نشان می دهد.

به دلیل نقش بسیار مهم پتاسیم در تحریک قلبی، افزایش ناشی از همولیز می تواند مشکل ساز باشد، به ویژه برای بیماران بخش اورژانس که در معرض خطر همولیز در هنگام جمع آوری خون هستند. حتی بدون همولیز، محدوده غلظت پتاسیم می تواند در ترکیبی از افراد سالم و بیمار گسترده باشد. سطوح پایین همولیز فقط باعث افزایش جزئی می شود، اما همولیز بسیار قوی می تواند سطح پتاسیم را 2 تا 3 میلی اکی والان در لیتر در محدوده بحرانی افزایش دهد.

مورد خاص دیگری که در آن هیپرکالمی کاذب می تواند رخ دهد، در بیمارانی است که تعداد بلاست بسیار بالا در لوسمی های فاز حاد یا تسریع شده دارند. این بلاست ها می توانند شکننده باشند و ممکن است در طی فلبوتومی استاندارد لیز شوند و پتاسیم آزاد کنند.

در مقابل، نمونه‌هایی با تعداد WBC بسیار بالا که به آرامی جمع‌آوری می‌شوند، زمانی که پتاسیم توسط سلول‌های لوسمی بسیار فعال متابولیکی همراه با گلوکز جذب می‌شود، می‌توانند هیپوکالمی کاذب را نشان دهند. چنین نمونه هایی را می توان روی یخ حمل کرد تا این جذب با واسطه آنزیمی را کاهش دهد.

به طور معمول، پلاکت ها در طول لخته شدن پتاسیم آزاد می کنند. بنابراین سرم مقدار کمی پتاسیم بالاتری نسبت به پلاسمای یک فرد دارد. این تفاوت زمانی تشدید می شود که تعداد پلاکت ها بسیار بالا باشد.

برای جلوگیری از مشکلات مربوط به غلظت خون و همودیلوشن، بیمار باید به مدت 15 تا 20 دقیقه قبل از خونگیری در وضعیت خوابیده بنشیند. استفاده طولانی مدت از تورنیکه می تواند باعث غلظت خون شود که باعث افزایش غلظت آنالیت ها و اجزای سلولی می شود.

هنگامی که از لوله های خونگیری که حاوی مواد ضد انعقاد/افزودنی مختلف هستند استفاده می شود، مهم است که ترتیب مناسب کشیدن را دنبال کرده و یک لوله ضد انعقاد خون را پس از پر شدن کاملاً مخلوط کنید. عدم مخلوط کردن لوله حاوی یک ضد انعقاد منجر به شکست در ضد انعقاد کل نمونه خون می شود و ممکن است لخته های کوچکی ایجاد شود. که به شمارش سلول های اشتباه می تواند منجر شود.

اگر لخته وجود داشته باشد، ممکن است آنالایزر خودکار را مسدود کند یا در غیر این صورت با آن تداخل ایجاد کند. استفاده از ضد انعقاد نادرست نتایج آزمایش را به شدت تحت تأثیر قرار می دهد.

مطلب پیشنهادی: لوله های آزمایش و ضد انعقادها

سرم ایکتریک(بیلی روبینمی) و لیپمیک چالش های بیشتری در آنالیز آزمایشگاهی ایجاد می کند. هنگامی که بیلی روبین سرم به 430 میلی مول در لیتر (25 میلی گرم در لیتر) نزدیک می شود، ممکن است تداخل در سنجش آلبومین (روش 4-هیدروکسیازوبنز 2-کربوکسیلیک اسید [HABA])، کلسترول (با استفاده از معرف های کلرید آهن)، و پروتئین کل(روش بیوره) مشاهده شود؛ روش سبز بروم کرزول کمتر مستعد تداخل بیلی روبین است.

مقادیر القا شده کاذب در برخی از مقادیر آزمایشگاهی زمانی حاصل می‌شود که سطوح تری گلیسیرید (کدورت) بر اساس جذب نور ذرات مختلف لیپیدی افزایش یابد. لیپمی زمانی رخ می دهد که سطح تری گلیسیرید سرم از 4.6 میلی مول در لیتر (400 میلی گرم در دسی لیتر) فراتر رود. ممکن است مهار سنجش آمیلاز، اورات، اوره، CK، بیلی روبین و پروتئین کل مشاهده شود.

برای تصحیح قرائت‌های جذب مصنوعی، ممکن است از روش‌های «بلانکینگ» (بلانک حاوی سرم اما فاقد عنصر حیاتی برای تکمیل سنجش است) یا روش‌های طول موج دوگانه استفاده شود. فرآیند خالی کردن ممکن است در برخی موارد کدورت موثر نباشد و برای پاکسازی سرم یا پلاسما از شیلومیکرون ها، ممکن است اولتراسانتریفیوژ لازم باشد.

متغیرهای وابسته به نمونه در آزمایش، در حین آنالیز و اثرات آن در نتایج آزمایش:

علاوه بر متغیرهای پیش از آنالیز که قبلاً مورد بحث قرار گرفت، شرایط و تداخل‌های خاصی وجود دارد که ممکن است بر آنالیز نمونه تأثیر بگذارد.

ایمونواسی ها:

بیوتین:

انواع مختلفی از مواد می توانند با سنجش ایمنی تداخل داشته باشند. که به نوبه خود می تواند منجر به تفسیر نادرست نتایج بیمار شود. به عنوان مثال، مکمل‌های بیوتین (که در سال‌های اخیر استفاده از آن‌ها افزایش یافته است) می‌توانند تداخل تحلیلی در سنجش ایمنی مبتنی بر بیوتین ایجاد کنند.

اخیراً مشخص شده است که مکمل‌های غذایی با بیوتین بدون نسخه با بسیاری از سنجش‌های ایمنی تجاری تداخل دارد و نتایج کاذب کم یا زیاد بالا را به همراه دارد. سازمان غذا و داروی ایالات متحده (FDA) در 28 نوامبر 2017 هشداری را در مورد خطاهای بالینی قابل توجه ناشی از تداخل بیوتین صادر کرد. مثال‌ها عبارتند از یک نتیجه کاذب پایین تروپونین که منجر به تشخیص اشتباه حمله قلبی و خطاهای هورمونی می‌شود.

دلیل این تداخل، پیکربندی سنجشی است که در آن تشکیل ساندویچ مولکولی یا مسدود شده و یا بیش از حد توسط غلظت‌های بالای بیوتین افزایش می‌یابد. در یکی از این طرح‌های سنجش اتصال رقابتی، آنالیت (به عنوان مثال، تیروتروپین، هورمون محرک تیروئید [TSH]) در نمونه خون آزمایشی به آنتی‌بادی جذب معرف متصل می‌شود و در نتیجه آنالیت آشکارساز معرف (برچسب‌شده با مولکول نورتابی شیمیایی) را جایگزین می‌کند.

آنتی بادی جذب شده با بیوتین جفت می شود (یعنی بیوتینیله) که به نوبه خود به استرپتاویدین پوشیده شده روی دانه های مغناطیسی متصل می شود. پس از شستن اجزای غیر متصل، مقدار آنالیت از نمونه با سیگنال مولکول آشکارساز محدود نسبت معکوس دارد. اگر نمونه بیمار دارای سطح بسیار بالایی از بیوتین آزاد باشد، به استرپتاویدین متصل می شود و اتصال آنتی بادی جذب به مهره ها را مسدود می کند. سیگنال حاصل به اشتباه به نظر می رسد که نمونه بیمار دارای سطح بسیار بالایی از آنالیت است. سایر پیکربندی‌های سنجش می‌توانند به اشتباه مقادیر پایینی را به همراه داشته باشند.

مقدار توصیه شده روزانه برای بیوتین 0/03 میلی گرم است، اما مکمل هایی که برای مو، پوست و ناخن فروخته می شوند ممکن است تا 20 میلی گرم بیوتین داشته باشند. برای درمان مولتیپل اسکلروزیس، تا 300 میلی گرم در روز ممکن است توصیه شود. این دوزهای بسیار بالای بیوتین می تواند منجر به غلظت 1200 نانوگرم در میلی لیتر در خون شود که به احتمال زیاد در سنجش های ایمنی حساس تداخل ایجاد می کند.

مطالعه سنجش‌های مختلف از یک سازنده، کاهش کاذب در تروپونین T، هورمون محرک فولیکول با حساسیت بالا و TSH، اما افزایش کاذب در تری یدوتیرونین(T3)  و ویتامین D از بیوتین را نشان داد، که نشان می‌دهد هر سنجش باید به‌طور جداگانه برای حساسیت خاص آن به تداخل ارزیابی شود.

شیوع مکمل بیوتین در بیماران سرپایی مورد بررسی توسط پرسشنامه 7/7 درصد بود. با اندازه‌گیری مستقیم، 7/4 درصد از بیماران بخش اورژانس دارای غلظت‌های بیوتین در سطح یا بالاتر از سطح شناخته شده برای تداخل در سنجش ایمنی یک سازنده بودند.

یک توصیه برای بیمارانی که مکمل‌های بیوتین مصرف می‌کنند این است که مصرف آن‌ها را به مدت 48 تا 72 ساعت قبل از آزمایش‌های خونی برنامه‌ریزی‌شده قطع کنند تا بیوتین محلول در آب از بدن آنها پاک شود. اقدامات آزمایشگاهی اضافی شامل داشتن روش‌های پشتیبان شناخته شده بدون تداخل بیوتین و ارتباط با پزشکان از طریق نظرات نتیجه است که سنجش‌های خاص مستعد تداخل بیوتین هستند.

آنتی بادی های مونوکلونال

مواد درون زا(Endogenous)، آنتی بادی های حیوانی علیه آنتی ژن های انسانی یا اتوآنتی بادی ها می توانند در واکنش بین آنتی بادی های آنالیت و معرف تداخل ایجاد کنند. تولیدکنندگان معمولاً برای مهار یا خنثی کردن تداخل، عوامل مسدودکننده را به معرف های ایمونواسی اضافه می کنند.

ایمونواسی از آنتی بادی های مشتق شده از گونه های مختلف استفاده می کند – به عنوان مثال، آنتی بادی موش. آنتی بادی های ضد موش انسانی (HAMA) که به آنها هتروفیل نیز گفته می شود، این آنتی بادی ها می توانند به دنبال تحریک آنتی ژنی از آنتی بادی های مونوکلونال درمانی موش ایجاد شوند که برای تغییر پاسخ های ایمنی (مانند آنتی بادی ضد سلول T)، برای اتصال و حذف سطوح سمی داروها تجویز می شوند. (به عنوان مثال، دیگوکسین)، یا برای حمله به تومورها.

برخی از افراد دارای HAMA هیچ سابقه ای از قرار گرفتن در معرض درمان با این آنتی بادی ها ندارند، اما می توان تصور کرد که از طریق غذای آلوده یا سایر منابع محیطی با پروتئین های موش مواجه شده باشند. اثر HAMAs در ایمونواسی می تواند به جذب متقاطع و سیگنال دادن به آنتی بادی ها در روش ساندویچی باشد که آنتی ژن واقعی را تقلید می کند.

به عنوان مثال، یک آزمایش ایمنی برای TSH که دارای آنتی بادی های جداگانه علیه زیرواحدهای α و β است، ممکن است نتیجه مثبت کاذب شگفت آور بالایی را در یک فرد یوتیروئیدی مبتلا به HAMA ایجاد کند. در این مورد، سایر تست های عملکرد تیروئید می تواند کاملا طبیعی باشد. وجود HAMA را می توان با اندازه گیری مستقیم تأیید کرد (معمولاً به آزمایشگاه مرجع ارسال می شود) و همچنین می تواند با جذب HAMA بر روی لوله های مخصوصی که با آنتی بادی های موش پوشانده شده اند و سپس اندازه گیری مجدد آنالیت برای بررسی کاهش قدرت سیگنال در نمونه تیمار شده اثر این آنتی بادی را خنثی کرد.

آنتی بادی های مونوکلونال با اهداف مولکولی خاص به سرعت وارد عمل بالینی می شود. یک مثال emicizumab است که به عنوان یک عامل بازدارنده فاکتور انعقاد VIII کاربرد دارد زیرا یک آنتی بادی مونوکلونال انسانی است که فاکتور انعقادی فعال IX و فاکتور X را به هم مرتبط می کند که عملکرد فاکتور VIII را تکرار می کند.

استفاده اولیه از آن برای بیماران هموفیلی A است که مقاومت (مثلاً مهارکننده) نسبت به تزریق فاکتور VIII دارند. به دلیل اثربخشی و سهولت نسبی تزریق زیر جلدی، استفاده در آینده ممکن است برای همه بیماران هموفیلی گسترش یابد.

متأسفانه، اتصال emicizumab به فاکتورهای IX و X نیز در سنجش‌های مبتنی بر زمان ترومبوپلاستین جزئی فعال (APTT) برای سطوح فاکتور VIII و برای سنجش مهارکننده‌ها حتی در سطوح بسیار پایین این آنتی‌بادی مونوکلونال رخ می‌دهد. به دلیل این تداخل، APTT نمی تواند برای مانیتور بیماران دریافت کننده emicizumab استفاده شود. یکی از راه‌حل‌های ممکن برای این تداخل، گنجاندن آنتی‌بادی‌های مونوکلونال ضد ایدیوتایپ خاص در آزمایش فاکتور هشت برای خنثی‌سازی هر گونه emicizumab موجود است.

نمونه دیگری از تداخل آنتی بادی مونوکلونال درمانی، داراتوموماب است که به عنوان درمانی برای مولتیپل میلوما تایید شده است و به طور فزاینده ای برای بدخیمی های سلول B استفاده می شود. اگرچه CD38 در سلول های پلاسما و تکثیر سلول های B وجود دارد، اما روی گلبول های قرمز نیز وجود دارد. بر این اساس، داراتوموماب تداخل واکنشی را با گلبول‌های قرمز معرف نشان می‌دهد و به عنوان آنتی‌بادی در برابر یک آنتی ژن با شیوع بالا در روش‌های سازگاری با بانک خون عمل می‌کند.

این تداخل می تواند حضور سایر آنتی بادی های مهم را بپوشاند. رویه‌هایی که برای مقابله با تداخل داراتوموماب انجام می‌شود شامل استفاده از دیتیوتریتول برای شکستن پیوندهای دی سولفید در CD38 و غیرفعال کردن آن آنتی ژن است (اما می‌تواند آنتی ژن‌های دیگر را نیز تجزیه کند). راهبردهای دیگر برای خنثی کردن فعالیت ضد CD38 شامل استفاده از قطعات محلول CD38 و آنتی بادی ضد ایدیوتیپ علیه آنتی بادی مونوکلونال داراتوموماب است.

اثرات ماتریس نمونه

آنالیت‌های بیوشیمیایی رایج – مانند الکترولیت‌ها، مولکول‌های کوچک، آنزیم‌ها و غیره- عموماً در فاز آب پلاسما یا سرم توزیع می‌شوند. در نتیجه، نمونه‌هایی با فاز آب کاهش یافته به دلیل هیپر پروتئینمی (به عنوان مثال، از غلظت‌های بسیار بالای پروتئین میلوما) یا هیپرلیپیدمی (به عنوان مثال، محتوای بالای شیلومیکرون). حتی با وجود خواص دیگر، مانند فعالیت‌های یونی می‌توانند، محتوای آنالیت‌های حلال را کاهش دهند.

در آن نمونه ها، ممکن است در محدوده فیزیولوژیکی طبیعی باشد. این پدیده اثر دفع حلال(solvent exclusion effect) نامیده می‌شود و به حذف آب و مولکول‌های کوچک در فاز آبی اشاره دارد، زمانی که حجم بیشتری در یک نمونه توسط پروتئین یا لیپید که آب را حذف می‌کند اشغال می‌کند.

محتوای مولکول های کوچک در هر حجم اسمولاریته است (که اندازه گیری می تواند اشتباه باشد)، در حالی که جنبه فیزیولوژیکی مهم، مانند فعالیت های یونی، اسمولالیته است. اگر علت چربی اضافی باشد، ممکن است با اولتراسانتریفیوژ حذف شوند. اگر تداخل به دلیل پروتئین اضافی باشد، می‌توان از یک روش تحلیل جایگزین، مانند الکترود یون انتخابی در نمونه رقیق‌نشده، برای ایجاد فعالیت صحیح الکترولیت (یعنی معادل اسمولالیته) استفاده کرد.

اثرات ماتریکس ناشی از غلظت‌های بسیار بالا یا بسیار پایین پروتئین‌ها و سایر ترکیبات ممکن است هنگام برخورد با سایر مایعات بدن مشکل‌ساز باشد، به‌ویژه زمانی که نمونه‌ها بسیار چسبناک یا غیر معمول هستند. در این شرایط، ممکن است لازم باشد نتایج در گزارش برای نشان دادن محل مایع بدن و محدودیت‌های احتمالی در دقت اندازه‌گیری واجد شرایط باشد.

تشخیص مولکولی

دستکاری های آزمایشگاهی اسیدهای نوکلئیک در مراحل مختلف، از جمله جمع آوری و پردازش نمونه، مستعد تداخل هستند. معرفی مواد بازدارنده و آلودگی با سیگنال های مثبت کاذب از جمله تداخل های مهم است. نمونه‌های خون برای آزمایش اسید نوکلئیک معمولاً در ضد انعقاد EDTA جمع‌آوری می‌شوند تا آنزیم‌هایی را که ممکن است آنها را تجزیه کنند، مهار کنند.

هپارین یک انتخاب ضعیف برای ضد انعقاد در این کاربرد است زیرا می‌تواند با DNA استخراج شود و DNA پلیمراز را در واکنش‌های زنجیره‌ای پلیمراز (PCRs) مهار می‌کند. هم(Heme) حاصل از همولیز در پلاسما یا سرم نیز می تواند DNA پلیمراز را مهار کند. RNA در خون یا بافت ها حساس است. بنابراین اگر استخراج به تعویق افتاد، این نمونه ها باید با انجماد سریع در نیتروژن مایع به طور مناسب ذخیره شوند.

استخراج اسیدهای نوکلئیک از نمونه‌های بالینی مانند پلاسما (به عنوان مثال برای اندازه‌گیری بار ویروسی)، سلول‌های خونی (مثلاً برای آزمایش ژنتیک)، یا بافت‌ها (مثلاً برای تجزیه و تحلیل جهش در تومورها) مستلزم لیز کردن سلول‌ها و جداسازی اسیدهای نوکلئیک از پروتئین‌ها و لیپیدها معرف های استخراج شامل نمک ها، پروتئازها و فنل کلروفرم برای دناتوره کردن مواد کمپلکس شده با اسیدهای نوکلئیک می باشد.

این فرآیند باید برای نوع نمونه بهینه شود تا اسیدهای نوکلئیک با کیفیت بالا با عملکرد کمی خوب بازیابی شود. باید مراقب بود که از آلودگی نمونه ها با اسیدهای نوکلئیک هدف از نمونه های دیگر یا با اهداف تقویت شده از نمونه هایی که قبلاً در آن مجاورت آنالیز شده اند جلوگیری شود. بر این اساس، آزمایشگاه‌هایی که تقویت اسید نوکلئیک، به ویژه PCR را انجام می‌دهند، باید دارای مناطق پیش‌تقویت(preamplification)، تقویت(amplification) و پس‌تقویت(postamplification) جداگانه با قوانین سخت‌گیرانه در مورد جابجایی پرسنل بین آنها باشند.

مطالب مرتبط در متااورگانون:

• لوله های آزمایش و ضد انعقادها
• ذخیره سازی نمونه های آزمایشگاهی
• مقادیر بحرانی در آزمایشگاه های تشخیص طبی
• تداخلات دارویی در آزمایش ها

 

📚Writing, Translation and Gathering:

🖌Dr. Farzad Babakhani🖌

• Master of Laboratory Science
• PhD in medical virology
• from Tehran University of Medical Sciences