واکنش زنجیره ای پلیمراز (PCR) | Polymerase Chain Reaction

واکنش زنجیره‌ای پلیمراز (PCR) یک تکنیک زیست‌شناسی مولکولی پرکاربرد است که امکان تکثیر بخش خاصی از DNA را فراهم می‌کند. اولین بار در دهه 1983 توسط کری مولیس توسعه یافت و از آن زمان به یک ابزار ضروری در زمینه های مختلف تحقیق، تشخیص و تجزیه و تحلیل پزشکی قانونی تبدیل شده است. فرآیند PCR شامل چندین چرخه از تغییرات دما است تا امکان تکثیر DNA مورد نظر را فراهم کند. این چرخه ها معمولاً از سه مرحله تشکیل می شوند: دناتوراسیون (Denaturation)، بازپخت (Annealing) و گسترش (Extension).

واکنش زنجیره ای پلیمراز (PCR) چیست؟

واکنش زنجیره‌ای پلیمراز (PCR) یک فرآیند آنزیمی پرکاربرد است که به دانشمندان اجازه می‌دهد یک ناحیه خاص از DNA را تکثیر کنند و در نتیجه نسخه‌های زیادی از یک توالی DNA خاص تولید شود. PCR اصول تکمیل هیبریداسیون اسید نوکلئیک و تکثیر اسید نوکلئیک را ترکیب می کند تا یک نسخه از یک توالی DNA هدف را تقویت کند، حتی اگر با روش های هیبریداسیون استاندارد غیرقابل تشخیص باشد. این فرآیند تقویت می‌تواند میلیون‌ها تا میلیاردها نسخه از DNA هدف را در مدت زمان نسبتاً کوتاهی تولید کند و مقدار فراوانی DNA را برای تجزیه و تحلیل بیشتر فراهم کند.

PCR در سال 1983 توسط بیوشیمیدان آمریکایی کری مولیس در شرکت Cetus اختراع شد، که برای آن جایزه نوبل شیمی در سال 1993 به طور مشترک با بیوشیمیدان مایکل اسمیت دریافت شد. PCR از زمان توسعه خود به یک تکنیک اساسی در آزمایشات و تحقیقات ژنتیکی تبدیل شده است. در طیف گسترده ای از کاربردها، از جمله تجزیه و تحلیل نمونه های DNA باستانی، شناسایی عوامل عفونی، شبیه سازی و دستکاری ژن، توالی یابی DNA، تشخیص اختلالات ژنتیکی، علم پزشکی قانونی، و تشخیص عوامل بیماری زا در بیماری های عفونی استفاده می شود.

روش PCR به طور معمول بر چرخه حرارتی متکی است که شامل قرار دادن واکنش در معرض چرخه های مکرر گرمایش و سرمایش است. این تغییرات دما واکنش‌های خاصی مانند ذوب DNA (جدا شدن دو رشته از هم) و تکثیر DNA مبتنی بر آنزیم را تسهیل می‌کند. دو جزء کلیدی PCR پرایمرها و DNA پلیمراز هستند. پرایمرها قطعات DNA تک رشته ای کوتاهی هستند که به نام الیگونوکلئوتیدها شناخته می شوند و مکمل ناحیه DNA هدف هستند. DNA پلیمراز آنزیمی است که مسئول مونتاژ رشته های DNA جدید با استفاده از آغازگرها و نوکلئوتیدهای آزاد است.

فرآیند PCR شامل چندین مرحله است. در مرحله دناتوراسیون اولیه، الگوی DNA دو رشته ای تا دمای بالا حرارت داده می شود و باعث جدا شدن دو رشته می شود. سپس دما کاهش می یابد و به پرایمرها اجازه می دهد تا به توالی های مکمل DNA متصل شوند. هنگامی که پرایمرها متصل شدند، DNA پلیمراز با استفاده از DNA الگو و نوکلئوتیدهای آزاد، یک رشته DNA جدید را سنتز می کند. این فرآیند چندین بار تکرار می شود و هر چرخه منجر به تقویت DNA هدف می شود. DNA تولید شده در یک چرخه به الگوی چرخه بعدی تبدیل می شود که منجر به افزایش نمایی (لگاریتمی) در مقدار DNA می شود.

برای اطمینان از موفقیت PCR، معمولاً از یک DNA پلیمراز پایدار در برابر حرارت استفاده می شود، مانند Taq polymerase، که در ابتدا از باکتری Thermus aquaticus جدا شده بود. Taq polymerase می تواند دمای بالای مرحله دناتوراسیون را بدون دناتوره شدن خود تحمل کند. قبل از استفاده از Taq پلیمراز، DNA پلیمراز باید به صورت دستی پس از هر چرخه اضافه می شد که فرآیندی زمان بر و پرهزینه بود.

PCR زمینه های مختلف تحقیقات و تشخیص را متحول کرده است. این دانشمندان را قادر می سازد تا مقادیر اندکی از DNA را تقویت و مطالعه کنند و بینش های ارزشمندی را در مورد اطلاعات ژنتیکی ارائه دهند و پیشرفت در زمینه هایی مانند پزشکی، پزشکی قانونی و زیست شناسی تکاملی را تسهیل کنند.

اصول واکنش زنجیره ای پلیمراز (PCR):

اصل واکنش زنجیره ای پلیمراز (PCR) شامل تقویت بخش خاصی از DNA از طریق یک سری چرخه دمایی است. این فرآیند با دناتوراسیون آغاز می شود، جایی که DNA هدف برای جداسازی دو رشته حرارت داده می شود و در نتیجه DNA تک رشته ای ایجاد می شود. در مرحله بعد، پرایمرهای خاصی که برای اتصال به هر رشته DNA هدف طراحی شده اند، اضافه می شوند. این پرایمرها به عنوان نقطه شروع سنتز DNA هستند.

در طول مرحله بازپخت یا annealing پرایمر، مخلوط واکنش تا دمایی خنک می‌شود که به پرایمرها اجازه می‌دهد به توالی‌های مکمل خود روی DNA هدف متصل شوند. هنگامی که پرایمرها متصل می شوند، DNA پلیمراز، آنزیمی که رشته های DNA جدید را سنتز می کند، پرایمرها را با افزودن نوکلئوتیدهای مکمل گسترش می دهد. این مرحله گسترش پرایمر در دمای بهینه برای فعالیت DNA پلیمراز رخ می دهد.

مراحل چرخه در PCR شامل تکرار چندین بار دناتوراسیون، بازپخت پرایمر و گسترش پرایمر است. هر چرخه منجر به تکثیر DNA هدف می شود. پس از 25 تا 30 چرخه، تعداد کپی های DNA هدف به دلیل تقویت نمایی (لگاریتمی) می تواند حداقل به 107 برسد.

PCR به طور معمول از یک سری تغییرات دما، به نام چرخه حرارتی (thermal cycling)، برای تسهیل مراحل مختلف استفاده می کند. مراحل چرخه معمولاً از سه تغییر دما تشکیل شده است: دناتوراسیون، بازپخت پرایمر و گسترش پرایمر. دناتوراسیون معمولاً در دمای بالا (حدود 94 تا 96 درجه سانتیگراد) برای جداسازی رشته های DNA انجام می شود. در طول بازپخت پرایمر، دما (حدود 45 تا 60 درجه سانتیگراد) کاهش می یابد تا پرایمرها به دنباله های هدف خود متصل شوند. در نهایت، گسترش پرایمر در دمای مطلوب برای فعالیت DNA پلیمراز، معمولاً در حدود 72 درجه سانتیگراد رخ می دهد.

روش‌های PCR اغلب شامل چرخه‌های متعدد این تغییرات دما هستند که به ترتیب با یک مرحله نگه‌دارنده در دماهای بالاتر و پایین‌تر شروع و پایان می‌یابند. مراحل نگه داری تکمیل فرمت محصول را تضمین می کند و امکان تجزیه و تحلیل یا ذخیره محصول نهایی PCR را فراهم می کند. در حالی که اکثر روش های PCR قطعات DNA را تا حدود 10 کیلو جفت باز (kb) تکثیر می کنند، برخی از تکنیک ها می توانند قطعات بزرگتر را تا 40 کیلوبایت نیز تقویت کنند.

اصول واکنش زنجیره ای پلیمراز (PCR)

الزامات واکنش زنجیره ای پلیمراز (PCR):

الزامات PCR شامل چندین جزء و شرایطی است که برای تکثیر موفق DNA ضروری است. در اینجا الزامات کلیدی PCR آورده شده است:

الگوی DNA: الگوی DNA هدفی است که تقویت خواهد شد. می توان آن را از منابع مختلفی مانند خون، بافت، نمونه های پزشکی قانونی یا سلول های میکروبی جدا کرد. الگوی DNA باید حاوی توالی هدفی باشد که باید تقویت شود.

پرایمرها: پرایمرها مولکول های DNA تک رشته ای کوتاهی هستند که به الگوی DNA متصل می شوند و نقطه شروعی برای سنتز DNA ایجاد می کنند. در PCR از دو پرایمر استفاده می شود: پرایمر فوروارد (Forward) که به یک رشته از DNA هدف متصل می شود و پرایمر معکوس (Reverse) که به رشته مکمل متصل می شود. پرایمرها باید به طور خاص برای توالی DNA هدف طراحی شوند تا از ویژگی و کارایی تقویت اطمینان حاصل شود.

طراحی پرایمر برای PCR شامل چندین مرحله مهم برای اطمینان از ویژگی و کارایی آنها در تقویت هدف DNA مورد نظر است. در اینجا یک مرور کلی از ملاحظات و مراحل کلیدی مربوط به طراحی پرایمر برای PCR آورده شده است:

1. شناسایی توالی هدف: توالی DNA خاصی را که می خواهید تقویت کنید، تعیین کنید. این می تواند یک ژن، یک ناحیه خاص از یک ژن یا هر قطعه DNA مورد علاقه دیگری باشد.
2. تجزیه و تحلیل توالی هدف: توالی نوکلئوتیدی DNA هدف را از پایگاه داده یا از طریق روش های توالی یابی به دست آورید. دنباله را برای هر گونه مسائل احتمالی، مانند توالی های تکراری، ساختارهای ثانویه، یا همسانی با سایر سکانس ها به دقت بررسی کنید.
3. تعیین طول پرایمر: پرایمرها معمولاً بین 18 تا 25 نوکلئوتید طول دارند. پرایمرهای کوتاهتر ممکن است فاقد ویژگی باشند، در حالی که پرایمرهای بلندتر می توانند بازده تقویت را کاهش دهند. طول حدود 20 نوکلئوتید را هدف قرار دهید، اما بر اساس نیازهای خاص انعطاف پذیر باشید.
4. محاسبه دمای ذوب (Tm): Tm دمایی است که در آن پرایمرها از قالب DNA در مرحله دناتوراسیون جدا می شوند. Tm را با استفاده از فرمول های تعیین شده که عواملی مانند طول آغازگر، محتوای G-C و غلظت نمک را در نظر می گیرند، محاسبه کنید. Tm هر دو پرایمر باید نزدیک به یکدیگر (در عرض چند درجه) باشد تا از تقویت متعادل اطمینان حاصل شود.
5. اجتناب از خود تکمیلی: ساختارهای خود مکمل یا سنجاق سر را در هر دنباله آغازگر بررسی کنید. اینها می توانند از اتصال پرایمر جلوگیری کنند یا منجر به تقویت غیر اختصاصی شوند. پرایمرهایی با حداقل خود تکمیلی را هدف قرار دهید و از مناطقی با ساختارهای ثانویه پایدار اجتناب کنید.
6. تجزیه و تحلیل برهمکنش پرایمر-پرایمر: برهمکنش های بالقوه بین پرایمرهای فوروارد (Forward) و معکوس (Reverse) را ارزیابی کنید. فعل و انفعالات ناخواسته، مانند تشکیل پرایمر-دایمر، می تواند در تقویت PCR اختلال ایجاد کند. از نرم افزارهای تخصصی یا ابزارهای آنلاین برای پیش بینی و اجتناب از چنین تعاملاتی استفاده کنید.
7.  بررسی ویژگی یا اختصاصیت: برای اطمینان از اختصاصی بودن پرایمر، جستجویی را در مورد توالی هدف و توالی‌های مرتبط (مانند ژن‌ها یا ژنوم‌های مشابه) انجام دهید. از مناطقی که همولوژی قابل توجهی با توالی های غیر هدف دارند اجتناب کنید، زیرا این امر می تواند منجر به تقویت غیر اختصاصی یا واکنش متقابل شود.
8. بررسی محتوای GC و انتهای پرایمر: برای بهینه سازی پایداری و ویژگی، محتوای G-C مناسب را در پرایمرها (حدود 40 تا 60 درصد) حفظ کنید. علاوه بر این، اطمینان حاصل کنید که انتهای پرایمر برای جلوگیری از تشکیل پرایمر-دایمر همسانی قابل توجهی ندارد.
9.  سنتز پرایمرها: هنگامی که طراحی پرایمر نهایی شد، پرایمرها را از یک تامین کننده معتبر سفارش دهید و از سنتز با کیفیت بالا اطمینان حاصل کنید.
10. اعتبار سنجی و بهینه سازی: با انجام تکثیر PCR با استفاده از DNA هدف و کنترل های مناسب، پرایمرها را به صورت تجربی تایید کنید. در صورت لزوم با تنظیم غلظت پرایمر، دمای بازپخت یا استفاده از مواد افزودنی مانند DMSO یا بتائین، شرایط PCR را بهینه کنید.

توجه به این نکته مهم است که چندین ابزار نرم افزاری و منابع آنلاین برای کمک به طراحی پرایمر در دسترس هستند، مانند Primer3، NCBI Primer-BLAST، یا بسته های نرم افزاری تجاری. این ابزارها می توانند به پیش بینی خواص پرایمر، ارزیابی ویژگی و بهینه سازی پارامترهای طراحی پرایمر کمک کنند.

DNA پلیمراز: DNA پلیمراز آنزیمی است که با افزودن نوکلئوتید به پرایمر رشته های DNA جدید را سنتز می کند. متداول ترین DNA پلیمراز مورد استفاده در PCR Taq DNA پلیمراز است که از باکتری Thermus aquaticus مشتق شده است. Taq پلیمراز مقاوم در برابر حرارت است و می تواند در برابر دماهای بالای مورد استفاده در حین دناتوراسیون مقاومت کند. سایر DNA پلیمرازها با قابلیت تصحیح مانند Pfu یا KOD پلیمراز نیز می توانند برای به حداقل رساندن خطاها در حین تقویت استفاده شوند.

نوکلئوتیدها: PCR برای سنتز رشته های DNA جدید به هر چهار دئوکسی نوکلئوزید تری فسفات (dNTPs) – آدنین (A)، گوانین (G)، سیتوزین (C) و تیمین (T) نیاز دارد. این نوکلئوتیدها در غلظت های مساوی به مخلوط واکنش اضافه می شوند.

محلول بافر: بافر PCR شرایط و مواد شیمیایی لازم را برای فعالیت بهینه و پایداری DNA پلیمراز فراهم می کند. معمولاً حاوی Tris-HCl برای حفظ pH، و KCl برای تثبیت بازپخت پرایمر-قالب و MgCl2 به عنوان کوفاکتور برای فعالیت DNA پلیمراز است. بسته به پروتکل PCR خاص ممکن است افزودنی های دیگری نیز گنجانده شوند.

کاتیون های تک ظرفیتی و دو ظرفیتی: کلرید پتاسیم (KCl) معمولاً به عنوان یک کاتیون تک ظرفیتی در واکنش های PCR برای بهینه سازی شرایط برای تقویت DNA استفاده می شود. کاتیون های دو ظرفیتی، مانند منیزیم (+Mg2)، به عنوان کوفاکتور برای فعالیت DNA پلیمراز ضروری هستند. یون های +Mg2 معمولاً در بافر PCR گنجانده می شوند، اگرچه منگنز (+Mn2) می تواند در موارد خاصی مانند جهش زایی DNA استفاده شود.

لوله PCR :PCR در لوله های پلاستیکی کوچک و جدار نازک به نام میکروتیوب PCR انجام می شود. این لوله ها امکان هدایت حرارتی کارآمد و تعادل دما را در طول فرآیند چرخه حرارتی فراهم می کنند.

چرخه حرارتی: چرخه حرارتی که به عنوان ترموسایکلر نیز شناخته می شود، وسیله ای است که برای گرم کردن و خنک کردن سریع مخلوط واکنش PCR در طول مراحل چرخه دما استفاده می شود. ترموسایکلرهای مدرن از اثر Peltier برای دستیابی به کنترل دقیق دما استفاده می کنند. آنها همچنین مجهز به درب های گرم شده برای جلوگیری از تراکم و تبخیر مخلوط واکنش هستند.

این الزامات، هنگامی که ترکیب و بهینه شوند، تقویت کارآمد توالی‌های DNA خاص با استفاده از PCR را ممکن می‌سازند.

شرح هر مرحله از واکنش زنجیره ای پلیمراز (PCR):

1. شروع اولیه (Initialization):

این مرحله در ابتدای واکنش PCR انجام می شود و شامل گرم کردن محفظه واکنش تا دمای خاصی است.

• هدف از مرحله اولیه اطمینان از فعال شدن کامل آنزیم DNA پلیمراز و آماده بودن برای انجام عملکرد خود در سنتز رشته های DNA جدید است. همه DNA پلیمرازها به این فعال سازی حرارتی نیاز ندارند، اما برای آنهایی که نیاز دارند، مقداردهی اولیه ضروری است.
• در طول شروع اولیه، محفظه واکنش معمولاً تا محدوده دمایی 94 تا 96 درجه سانتیگراد گرم می شود. با این حال، اگر از پلیمرازهای بسیار مقاوم در برابر حرارت استفاده شود، دما را می توان تا 98 درجه سانتیگراد افزایش داد. دمای خاص مورد استفاده بستگی به نیازهای DNA پلیمراز خاص مورد استفاده دارد.
• مدت زمان مرحله اولیه می تواند متفاوت باشد و به طور کلی برای 1 تا 10 دقیقه نگه داشته می شود. این زمان به DNA پلیمراز اجازه می دهد تا تحت تغییرات ساختاری لازم قرار گیرد و آن را قادر می سازد به حالت بهینه خود برای سنتز DNA برسد.
• با قرار دادن محفظه واکنش در این دمای بالا در طول شروع اولیه، هرگونه فعالیت آنزیمی باقیمانده که می تواند منجر به تقویت غیر اختصاصی یا تشکیل پرایمر-دایمر شود به حداقل می رسد یا حذف می شود. این رویکرد به بهبود ویژگی و کارایی واکنش PCR با جلوگیری از تقویت DNA نامطلوب قبل از شروع مراحل واقعی چرخه کمک می کند.
• به طور کلی، مرحله اولیه در PCR برای اطمینان از فعال شدن DNA پلیمرازهایی که نیاز به فعال سازی حرارتی دارند، بسیار مهم است. با گرم کردن محفظه واکنش تا یک دمای خاص و نگه داشتن آن برای یک دوره مشخص، آنزیم DNA پلیمراز برای مراحل بعدی مانند دناتوراسیون، بازپخت و گسترش آماده می شود که منجر به تقویت موفقیت آمیز DNA می شود.

2. دناتوره شدن (Denaturation):

• دناتوره شدن یک مرحله مهم در فرآیند واکنش زنجیره ای پلیمراز (PCR) است. این اولین رویداد چرخه منظم است که پس از مرحله اولیه رخ می دهد. دناتوره سازی شامل حرارت دادن محفظه واکنش تا محدوده دمایی 94 تا 98 درجه سانتیگراد به مدت 20 30 ثانیه است.
• هدف اولیه مرحله دناتوراسیون القای ذوب یا جداسازی الگوی DNA دو رشته ای به دو مولکول DNA تک رشته ای است. این فرآیند با شکستن پیوندهای هیدروژنی که پایه های مکمل رشته های DNA را در کنار هم نگه می دارند، حاصل می شود. در نتیجه، الگوی DNA دو رشته ای به قالب های DNA تک رشته ای تبدیل می شود، که به عنوان نقطه شروع برای مراحل بعدی واکنش PCR عمل می کند.
• دمای بالای استفاده شده در حین دناتوراسیون، پیوند هیدروژنی بین دو رشته DNA مکمل را مختل می کند. مولکول DNA باز می شود و دو رشته از یکدیگر جدا می شوند. گرما انرژی لازم برای غلبه بر نیروهای پیوند هیدروژنی بین جفت‌های پایه را فراهم می‌کند و در نتیجه جداسازی رشته‌ها را افزایش می‌دهد. این مرحله دناتوراسیون بسیار مهم است زیرا امکان دسترسی به الگوی DNA را برای اتصال پرایمرها در مرحله بازپخت بعدی فراهم می کند.
• با تولید قالب‌های DNA تک رشته‌ای، دناتوراسیون پرایمرها را قادر می‌سازد تا در مرحله بعدی PCR به توالی‌های مکمل خود بازپخت شوند. مرحله دناتوراسیون تضمین می کند که الگوی DNA در یک ترکیب مناسب برای اتصال پرایمر کارآمد و سنتز DNA بعدی است.
• مدت مرحله دناتوراسیون نسبتا کوتاه است و معمولاً بین 20 تا 30 ثانیه است. این قرار گرفتن کوتاه مدت در دمای بالا برای برهم زدن پیوندهای هیدروژنی و جداسازی رشته های DNA بدون ایجاد آسیب قابل توجه به مولکول های DNA کافی است.

3. بازپخت (Annealing):

• بازپخت یک مرحله مهم در فرآیند واکنش زنجیره ای پلیمراز (PCR) است که به دنبال دناتوره شدن انجام می شود. در طول بازپخت، دمای واکنش به مدت 20 تا 40 ثانیه به محدوده 50 تا 65 درجه سانتیگراد کاهش می یابد. این محدوده دمایی امکان اتصال اختصاصی پرایمرها به هر یک از الگوهای DNA تک رشته ای ایجاد شده در طول دناتوره شدن را فراهم می کند.
• در PCR، دو پرایمر مختلف به طور معمول در مخلوط واکنش گنجانده می شوند. هر پرایمر برای تکمیل یک توالی کوتاه از نوکلئوتیدها در انتهای 3′ یکی از الگوهای DNA تک رشته ای حاوی ناحیه هدف طراحی شده است. پرایمرها خود توالی های تک رشته ای هستند و بسیار کوتاهتر از طول کلی ناحیه هدف هستند.
• دمای بازپخت یک پارامتر حیاتی برای تعیین است زیرا مستقیماً بر کارایی و ویژگی اتصال پرایمر تأثیر می گذارد. دما باید به اندازه کافی پایین باشد تا امکان هیبریداسیون یا اتصال پرایمرها به توالی های مکمل خود را در قالب های DNA تک رشته ای فراهم کند. با این حال، همچنین باید به اندازه کافی بالا باشد تا از اتصال خاص اطمینان حاصل شود، جایی که پرایمرها فقط به توالی های کاملا مکمل خود متصل می شوند و در هیچ جای دیگری نیستند.
• اگر دمای بازپخت خیلی پایین باشد، پرایمرها ممکن است به طور ناقص به مناطق غیر اختصاصی الگوی DNA متصل شوند و منجر به تقویت غیر اختصاصی و محصولات نامطلوب شوند. از طرف دیگر، اگر دما خیلی بالا باشد، ممکن است پرایمرها به هیچ وجه نتوانند متصل شوند و در نتیجه تقویت نشود.
• دمای بازپخت معمولی حدود 3 تا 5 درجه سانتیگراد کمتر از دمای ذوب (Tm) پرایمرهای مورد استفاده تنظیم شده است. Tm نشان دهنده دمایی است که در آن پیوندهای هیدروژنی پایدار بین پایه های مکمل تشکیل می شود. در طول بازپخت، توالی پرایمر باید دقیقاً با توالی قالب مطابقت داشته باشد تا امکان اتصال پایدار و خاص فراهم شود.
• در طول مرحله بازپخت، آنزیم DNA پلیمراز به هیبرید پرایمر-الگوی تشکیل شده از بازپخت پرایمرها به توالی های مکمل آنها روی الگوهای DNA تک رشته ای متصل می شود. پلیمراز، پس از اتصال، سنتز یک رشته DNA جدید مکمل الگوی DNA را آغاز می کند. این سنتز DNA آغاز تقویت DNA در PCR است.

4. گسترش (Extension) / ازدیاد طول (elongation)

• مرحله گسترش/ ازدیاد طول بخش مهمی از فرآیند واکنش زنجیره ای پلیمراز (PCR) است که به دنبال دناتوره شدن و بازپخت انجام می شود. دمای این مرحله به DNA پلیمراز مورد استفاده بستگی دارد. به عنوان مثال، DNA پلیمراز Taq پلیمراز مقاوم در برابر حرارت دارای دمای فعالیت بهینه حدود 75 تا 80 درجه سانتیگراد است، اگرچه دمای 72 درجه سانتیگراد معمولاً با این آنزیم استفاده می شود.
• در طول مرحله گسترش/ ازدیاد طول، DNA پلیمراز یک رشته DNA جدید را که مکمل رشته الگوی DNA است، سنتز می کند. این سنتز با افزودن دئوکسی ریبونوکلئوتیدهای آزاد (dNTPs) از مخلوط واکنش صورت می گیرد. dNTP ها مکمل توالی الگو هستند و در جهت 5′-to-3′ اضافه می شوند که جهت سنتز DNA است. آنزیم پلیمراز واکنش تراکم را کاتالیز می کند و گروه 5′-فسفات dNTPs را با گروه 3′-هیدروکسی در انتهای رشته DNA نوپای می پیوندد. این فرآیند منجر به طویل شدن رشته DNA می شود.
• زمان مورد نیاز برای افزایش طول به عواملی مانند DNA پلیمراز خاص مورد استفاده و طول ناحیه هدف DNA در حال تقویت بستگی دارد. به عنوان یک دستورالعمل کلی، اکثر DNA پلیمرازها می توانند تقریباً هزار باز در دقیقه در دمای بهینه خود پلیمریزه کنند.
• تحت شرایط بهینه و بدون محدودیت به دلیل محدود کردن سوبستراها یا معرف ها، هر مرحله گسترش/ ازدیاد طول در PCR تعداد توالی های هدف DNA را دو برابر می کند. این به این دلیل است که رشته‌های الگوی اصلی، و همچنین تمام رشته‌های تازه تولید شده، به رشته‌های الگو برای دور بعدی کشیدگی تبدیل می‌شوند. این پدیده با پیشرفت چرخه های PCR منجر به تقویت نمایی (هندسی) ناحیه هدف DNA خاص می شود.
• فرآیندهای دناتوراسیون، بازپخت و طویل شدن با هم یک چرخه واحد را در PCR تشکیل می دهند. با این حال، چرخه های متعدد برای تقویت هدف DNA به میلیون ها نسخه ضروری است. فرمول مورد استفاده برای محاسبه تعداد کپی های DNA تشکیل شده پس از یک تعداد چرخه معین 2^n است که n نشان دهنده تعداد چرخه ها است. برای مثال، مجموعه واکنش برای 30 چرخه منجر به 2^30 یا 1,073,741,824 کپی از ناحیه هدف DNA دو رشته ای اصلی می شود.

5. ازدیاد طول نهایی (Final elongation):

• مرحله نهایی افزایش طول در واکنش زنجیره ای پلیمراز (PCR) یک مرحله اختیاری است اما اغلب استفاده می شود که پس از آخرین چرخه PCR رخ می دهد. هدف آن اطمینان از اینکه DNA تک رشته ای باقیمانده در مخلوط واکنش به طور کامل منجر به تکمیل سنتز DNA می شود.
• در طول مرحله ازدیاد طول نهایی، دمای واکنش معمولاً در محدوده 70 تا 74 درجه سانتیگراد تنظیم می شود. این محدوده دما به این دلیل انتخاب شده است که از فعالیت بهینه اکثر پلیمرازهای مورد استفاده در PCR پشتیبانی می کند. با نگهداری مخلوط را می توان به طور موثر دراز کرد.
• منطق پشت این مرحله این است که زمان بیشتری برای DNA پلیمراز در نظر گرفته شود تا سنتز هر رشته DNA نیمه کشیده را تکمیل کند. با طولانی‌تر کردن دوره انکوباسیون، هر گونه گسترش یا شکاف ناقص در رشته‌های DNA سنتز شده را می‌توان پر کرد و در نتیجه مولکول‌های DNA دو رشته‌ای کامل‌تر و کاملاً درازتر به وجود آمد.
• در حالی که مرحله ازدیاد طول نهایی برای تقویت موفقیت آمیز PCR الزامی نیست، اما می تواند در کاربردهای خاص مفید باشد. این تضمین می کند که تمام الگوهای DNA تک رشته ای موجود به طور کامل گسترش یافته اند و شانس محصولات تقویت ناقص یا کوتاه شده را کاهش می دهد. علاوه بر این، زمانی که DNA تقویت شده برای کاربردهای پایین دستی که نیاز به سنتز DNA با وفاداری بالا دارند، ممکن است مفید باشد.

6. نگه داشتن نهایی (Final hold):

• مرحله نهایی در واکنش زنجیره ای پلیمراز (PCR) “نگهداری نهایی” است. این شامل خنک کردن محفظه واکنش تا محدوده دمایی 4 تا 15 درجه سانتیگراد و حفظ این دما برای مدت زمان نامحدود است. این مرحله معمولاً پس از اتمام چرخه های تقویت PCR انجام می شود.
• هدف از نگهداری نهایی فراهم کردن محیطی مناسب برای نگهداری کوتاه مدت محصولات PCR است. با کاهش دما تا محدوده سرد، به تثبیت و حفظ مولکول های DNA تقویت شده تا زمانی که تجزیه و تحلیل یا پردازش بیشتر انجام شود، کمک می کند. دمای خاص در محدوده 4 تا 15 درجه سانتیگراد ممکن است بسته به نیازهای خاص آزمایش یا پروتکل متفاوت باشد.
• در حین نگهداری نهایی، واکنش اساساً متوقف می شود و محصولات PCR در دمای پایین نگه داشته می شوند. این امکان جابجایی و ذخیره سازی راحت DNA تقویت شده را بدون تخریب یا از دست دادن یکپارچگی فراهم می کند. مدت زمان نگهداری نهایی می تواند بسته به نیازهای فوری آزمایش یا زمان مورد نیاز برای مراحل بعدی متفاوت باشد.
• با استفاده از نگهدارنده نهایی، محققان می توانند به طور موقت محصولات PCR را قبل از تجزیه و تحلیل بیشتر، مانند الکتروفورز ژل، توالی یابی یا سایر کاربردهای پایین دستی ذخیره کنند. این مرحله به حفظ یکپارچگی DNA تقویت‌شده کمک می‌کند و امکان انعطاف‌پذیری را در زمان‌بندی آزمایش‌ها یا رویه‌های بعدی فراهم می‌کند.
  

  واکنش زنجیره ای پلیمراز (PCR)

مراحل مختلف واکنش زنجیره ای پلیمراز (PCR):

واکنش زنجیره ای پلیمراز (PCR) را می توان بر اساس پیشرفت واکنش به سه مرحله تقسیم کرد: تقویت نمایی (exponential amplification)، همسطح کردن (leveling off) و پلاتو (plateau).

تقویت نمایی (exponential amplification):

در این مرحله واکنش PCR تحت رشد نمایی قرار می گیرد که منجر به افزایش سریع مقدار محصول DNA مورد نظر می شود. هر چرخه PCR با فرض 100 درصد راندمان واکنش، مقدار DNA را دو برابر می کند. به عنوان مثال، پس از 30 چرخه، یک نسخه از DNA را می توان تا 1,000,000,000 (یک میلیارد) کپی تقویت کرد. این مرحله قدرت تقویت قابل توجه PCR را نشان می دهد که امکان تکثیر یک توالی DNA خاص را در یک محیط آزمایشگاهی کنترل شده فراهم می کند. حتی مقادیر بسیار کمی از DNA هدف برای تشخیص و تجزیه و تحلیل کافی است.

همسطح کردن (leveling off):

با پیشرفت واکنش PCR، سرعت تقویت شروع به کاهش می کند. این مرحله با کاهش نرخ انباشت محصول مشخص می شود. عوامل متعددی در این کندی نقش دارند. آنزیم DNA پلیمراز ممکن است با گذشت زمان شروع به از دست دادن فعالیت خود کند و کارایی خود را در سنتز رشته های DNA جدید کاهش دهد. علاوه بر این، مصرف معرف‌هایی مانند دئوکسی نوکلئوتید تری فسفات‌ها (dNTPs) و پرایمرها، به تدریج در دسترس بودن آنها را کاهش می‌دهد و سهم آنها را در واکنش محدود می‌کند. این عوامل در مجموع منجر به کاهش نرخ تقویت در مقایسه با فاز نمایی قبلی می شوند

پلاتو (plateau):

در مرحله پلاتو افزایش بیشتری در تجمع محصول مشاهده نمی شود. این زمانی اتفاق می‌افتد که معرف‌ها و آنزیم مورد نیاز برای واکنش PCR کاملاً از بین می‌روند. همانطور که واکنش پیشرفت می کند و در چرخه های متعدد ادامه می یابد، در دسترس بودن محدود dNTP ها و پرایمرها از سنتز بیشتر DNA جلوگیری می کند. علاوه بر این، آنزیم DNA پلیمراز ممکن است به طور کامل مورد استفاده قرار گیرد یا تجزیه شود و مانع تولید رشته های جدید DNA شود. واکنش به نقطه ای می رسد که هیچ تقویت قابل توجهی رخ نمی دهد و مقدار محصول کاهش می یابد.

این سه مرحله از PCR ماهیت دینامیکی واکنش را نشان می‌دهد و اهمیت بهینه‌سازی شرایط واکنش، از جمله غلظت معرف و پارامترهای چرخه‌ای، برای دستیابی به حداکثر بازده تقویت را برجسته می‌کند. مرحله تقویت نمایی توانایی قدرتمند PCR برای تولید سریع میلیون ها یا میلیاردها نسخه از یک هدف DNA خاص را نشان می دهد. با این حال، نظارت بر پیشرفت واکنش و در نظر گرفتن محدودیت های تحمیل شده توسط در دسترس بودن معرف و فعالیت آنزیم بسیار مهم است، زیرا واکنش به مراحل همسطح کردن و فلات پیشرفت می کند.

پس از اتمام PCR، الکتروفورز ژل آگارز را انجام دهید. محصول تقویت شده را با ladder مقایسه کنید و اندازه آن را تعیین کنید.

تایید واکنش زنجیره ای پلیمراز (PCR):

اعتبارسنجی PCR یک مرحله ضروری برای اطمینان از موفقیت و دقت فرآیند تقویت است. برای تایید نتایج PCR می توان از چندین روش استفاده کرد. بیایید برخی از تکنیک های رایج اعتبار سنجی را بررسی کنیم:

رنگ آمیزی اتیدیوم بروماید: اتیدیوم بروماید (EtBr) یک رنگ رایج برای رنگ آمیزی محصولات DNA تقویت شده است. بین جفت های پایه مارپیچ دوتایی قرار می گیرد و می توان آن را زیر نور UV مشاهده کرد. EtBr دارای حداکثر جذب UV در 300 و 360 نانومتر، با حداکثر انتشار در 590 نانومتر است. با رنگ آمیزی باندهای DNA می توان حضور و شدت محصول تقویت شده را تعیین کرد. حد تشخیص DNA متصل به اتیدیوم بروماید معمولاً حدود 0/5 تا 5/0 نانوگرم در هر باند است.

رویکرد ترکیبی سه پرایمر: در برخی موارد، رویکرد ترکیبی سه پرایمر را می توان برای برچسب گذاری نهایی مقرون به صرفه تر محصولات PCR به کار برد. این رویکرد شامل استفاده از یک پرایمر جهانی با برچسب فلورسنت، پرایمرهای اختصاصی مکان تغییر یافته و دنباله‌های ’5 پرایمر جهانی است. استفاده از برچسب های فلورسنت امکان تجسم مستقیم و تعیین کمیت محصولات PCR را فراهم می کند.

الکتروفورز ژل آگارز: الکتروفورز ژل آگارز متداول ترین روشی است که برای تایید نتایج PCR استفاده می شود. این تکنیک از جریان الکتریکی برای جداسازی مولکول های DNA بر اساس اندازه آنها استفاده می کند. ژل آگارز برای قطعات DNA بزرگتر از 500 جفت باز استفاده می شود، در حالی که ژل پلی آکریل آمید برای قطعات کوچکتر استفاده می شود.

پس از الکتروفورز، نوارهای DNA با رنگ‌آمیزی ژل با رنگ‌های مخصوص DNA مانند اتیدیوم بروماید مشاهده می‌شوند. وجود یک باند DNA با اندازه مورد انتظار که با استفاده از نردبان DNA به عنوان مرجع اندازه تایید شده است، نشان دهنده تقویت موفقیت آمیز توالی هدف است. عدم وجود هر باند DNA نشان دهنده عدم وجود DNA هدف است، در حالی که وجود نوارهای DNA با اندازه نادرست نشان دهنده تولید محصولات ناخواسته است.

هضم با آنزیم محدود کننده: اگر توالی یابی مستقیم DNA در دسترس یا مقرون به صرفه نباشد، هضم آنزیم محدودکننده می تواند به عنوان یک روش غیر مستقیم برای ارزیابی توالی آمپلیکون PCR استفاده شود. با انتخاب آنزیم‌های محدودکننده مناسب که توالی‌های DNA خاص را در آمپلیکون تشخیص می‌دهند، وجود یا عدم وجود قطعات محدودکننده مورد انتظار می‌تواند اطلاعاتی در مورد یکپارچگی و ویژگی محصول تقویت‌شده ارائه دهد.

اعتبارسنجی نتایج PCR با استفاده از این تکنیک ها به اطمینان از قابلیت اطمینان و دقت فرآیند تقویت کمک می کند. این روش‌ها محققان را قادر می‌سازد تا حضور توالی هدف را تأیید کنند، محصولات ناخواسته را شناسایی کنند و موفقیت کلی آزمایش PCR را ارزیابی کنند.

انواع واکنش زنجیره ای پلیمراز (PCR):

PCR (واکنش زنجیره ای پلیمراز) یک تکنیک همه کاره است که برای رفع نیازهای خاص در زمینه های مختلف دستخوش تغییرات و سازگاری های مختلفی شده است. در اینجا برخی از انواع رایج تکنیک های PCR آورده شده است:

PCR معمولی: این روش استاندارد PCR است که در آن از یک جفت پرایمر برای اتصال به دو رشته هدف جدا شده استفاده می شود. میلیون ها نسخه از توالی DNA هدف تولید می کند.

Multiplex PCR: این تکنیک تخصصی PCR از چندین جفت پرایمر استفاده می کند که به توالی های هدف مختلف در یک نمونه واحد بازپخت می شوند. معمولاً برای تشخیص میکروارگانیسم‌های بیماری‌زا استفاده می‌شود و می‌تواند جهش‌ها، حذف‌ها، درج‌ها و بازآرایی‌ها را در نمونه‌های بیماری‌زا شناسایی کند.

Nested PCR: این روش برای افزایش اختصاصیت تکثیر DNA با کاهش تکثیر غیر اختصاصی استفاده می شود. این شامل دو مجموعه از جفت پرایمر است که در واکنش های متوالی PCR استفاده می شود. دور اول PCR یک محصول DNA بزرگتر را تولید می کند که شامل توالی هدف است و PCR دوم فقط توالی هدف خاص را تقویت می کند و ویژگی را بهبود می بخشد.

Real-time PCR/Quantitative PCR (qPCR): این تکنیک امکان تعیین کمیت تکثیر DNA را در زمان واقعی در طی واکنش PCR می دهد. معمولاً برای تخمین تعداد اهداف DNA موجود در یک نمونه یا مطالعه و مقایسه بیان ژن استفاده می شود. PCR بلادرنگ می تواند از رنگ های فلورسنت غیر اختصاصی یا پروب های فلورسنت الیگونوکلئوتیدی DNA اختصاصی برای اندازه گیری تقویت استفاده کند.

Hot Start/Cold Finish PCR: این تکنیک PCR تقویت غیر اختصاصی را در مراحل اولیه PCR کاهش می دهد. این شامل استفاده از پلیمرازهای هیبریدی است که در دمای محیط غیر فعال می مانند و فقط در دماهای بالاتر فعال می شوند. مهار فعالیت پلیمراز در دماهای پایین تر را می توان با استفاده از یک آنتی بادی یا مهارکننده های متصل کووالانسی به دست آورد.

Touchdown PCR (Step-down PCR): این روش برای به حداقل رساندن تقویت غیر اختصاصی با کاهش تدریجی دمای بازپخت پرایمر در سیکل های متوالی طراحی شده است. با چرخه‌های اولیه با دمای بازپخت بالاتر برای افزایش ویژگی شروع می‌شود و به تدریج دما را برای تقویت کارآمدتر کاهش می‌دهد.
Assembly PCR or Polymerase Cycling Assembly (PCA): این تکنیک برای سنتز مولکول های DNA بلند از الیگونوکلئوتیدهای بلند با قطعات همپوشانی کوتاه استفاده می شود. این شامل یک PCR اولیه با پرایمرهایی است که دارای همپوشانی هستند، به دنبال آن یک PCR دوم با استفاده از محصولات اولین PCR به عنوان الگوهایی برای تولید ساختار نهایی DNA تمام طول انجام می شود.

Colony PCR: این یک تکنیک با توان عملیاتی بالا است که برای تایید حضور درج های DNA در کلون های نوترکیب استفاده می شود. توالی های درج شده را با استفاده از پرایمرهای خاص طراحی شده برای نواحی بردار طرفین محل درج تقویت می کند. این تکنیک امکان غربالگری کلنی های باکتریایی تبدیل شده با وکتورهای نوترکیب را بدون استخراج اولیه DNA ژنومی فراهم می کند.

Methylation-Specific PCR (MSP): این گونه ای از PCR است که برای شناسایی هایپر متیلاسیون پروموتر در جزایر CpG استفاده می شود. این شامل درمان DNA هدف با بی سولفیت سدیم برای تبدیل بازهای سیتوزین غیر متیله به اوراسیل است. دو نوع پرایمر، مخصوص سیتوزین متیله و غیر متیله، برای تکثیر DNA اصلاح شده استفاده می شود که اطلاعات کمی در مورد متیلاسیون در صورت استفاده در PCR کمی ارائه می دهد.

Inverse PCR: این روش برای تشخیص توالی های اطراف DNA هدف (توالی های جانبی) استفاده می شود. این شامل یک سری از هضم آنزیم های محدود کننده است. سپس پرایمرها برای تقویت توالی در هر دو انتهای بخش DNA هدف، که از بخش DNA شناخته شده به سمت خارج گسترش می یابند، استفاده می شود.

Reverse Transcription-PCR (RTP): این روش RNA را به DNA مکمل (cDNA) با استفاده از رونوشت معکوس ویروسی و به دنبال آن یک PCR معمولی با استفاده از cDNA حاصل به عنوان یک الگو ترکیب می کند. این تکنیک به طور گسترده در تشخیص ویروس های RNA و مطالعه بیان ژن استفاده می شود. گونه‌ای به نام differential-display reverse transcription-PCR یا RNA arbitrarily primed PCR (RAP-PCR) امکان مقایسه بیان ژن را در شرایط مختلف فراهم می‌کند.

مزایای واکنش زنجیره ای پلیمراز (PCR):

PCR دارای چندین مزیت است که آن را به یک تکنیک پرکاربرد و قدرتمند در زمینه های مختلف تبدیل کرده است. در اینجا برخی از مزایای کلیدی PCR وجود دارد:

سادگی و سرعت: PCR یک تکنیک نسبتا ساده برای درک و انجام است. این شامل چند مرحله اساسی است و می تواند در مدت زمان نسبتاً کوتاهی، معمولاً چند ساعت، انجام شود. این زمان چرخش سریع امکان تشخیص و شناسایی سریع توالی های هدف را فراهم می کند.

حساسیت بالا: PCR بسیار حساس است و این پتانسیل را دارد که حتی مقادیر کمی از DNA هدف را تقویت کند. این می‌تواند میلیون‌ها تا میلیاردها کپی از یک قطعه DNA خاص تولید کند، که آن را برای کاربردهایی که به حساسیت بالایی نیاز دارند، مانند شناسایی انواع ژنتیکی نادر یا پاتوژن‌های با فراوانی کم، مناسب می‌سازد.

قابلیت های کمی سازی: Real-time Quantitative PCR (qPCR) گونه ای از PCR است که امکان تعیین کمیت محصول سنتز شده را در زمان واقعی فراهم می کند. این ویژگی به ویژه برای تجزیه و تحلیل تغییرات در سطوح بیان ژن، مانند تومورها یا عفونت های میکروبی مفید است. qPCR محققان را قادر می سازد تا سطوح بیان ژن را در نمونه های مختلف به طور دقیق اندازه گیری و مقایسه کنند.

تطبیق پذیری و انعطاف پذیری: PCR یک تکنیک همه کاره است که می تواند در کاربردهای مختلف استفاده شود. این امکان را برای تکثیر DNA از طیف گسترده ای از منابع، از جمله DNA ژنومی، cDNA، و حتی نمونه های DNA تخریب شده یا قدیمی فراهم می کند. می توان آن را برای اهداف مختلفی مانند توالی یابی، شبیه سازی، تجزیه و تحلیل جهش و ژنوتیپ سازگار کرد.

اختصاصیت: PCR هنگامی که به درستی طراحی شود، ویژگی بالایی را ارائه می دهد. با استفاده از پرایمرهای خاصی که توالی DNA مورد نظر را هدف قرار می دهند، PCR می تواند به طور انتخابی ناحیه مورد نظر را تقویت کند و در عین حال تکثیر DNA غیر هدف را به حداقل برساند. این ویژگی نتایج قابل اعتماد و دقیق را تضمین می کند.

ابزار تحقیق: PCR ابزاری قدرتمند در تحقیقات است که امکان تعیین توالی علل ناشناخته بیماری و شناسایی سویه های ویروسی جدید را فراهم می کند. این به محققان اجازه می دهد تا توالی ویروس های ناشناخته قبلی مرتبط با ویروس های شناخته شده را شناسایی کنند و درک بهتری از بیماری ها ارائه دهند. PCR به پیشرفت علم ژنومیک، زیست شناسی مولکولی و تحقیقات تشخیصی کمک زیادی کرده است.

تشخیص و شناسایی پیشرفته: PCR به طور قابل توجهی تشخیص و شناسایی بیماری های مختلف را بهبود بخشیده است. تشخیص سریع و حساس پاتوژن ها، اختلالات ژنتیکی و جهش های مرتبط با سرطان را امکان پذیر می کند. آزمایش‌های مبتنی بر PCR به بخشی جدایی ناپذیر از آزمایشگاه‌های بالینی تبدیل شده‌اند و نتایج سریع‌تر و دقیق‌تری برای تشخیص بیماری ارائه می‌دهند.

به طور کلی، سادگی، سرعت، حساسیت، قابلیت‌های کمی‌سازی، تطبیق پذیری، ویژگی و تأثیر آن بر تحقیقات و تشخیص PCR، آن را به ابزاری ضروری در زیست‌شناسی مولکولی، ژنتیک و کاربردهای بالینی تبدیل کرده است. انتظار می رود که توسعه و اصلاح مداوم آن، کاربردهای آن را بیشتر افزایش دهد و به پیشرفت در رشته های مختلف علمی کمک کند.

محدودیت های واکنش زنجیره ای پلیمراز (PCR):

در حالی که PCR انقلابی در علوم زیستی ایجاد کرده و پیشرفت های قابل توجهی را ممکن ساخته است، محدودیت های خاصی نیز دارد که باید در نظر گرفته شود. در اینجا برخی از محدودیت های PCR وجود دارد:

• نیاز به توالی هدف: PCR نیاز به دانش قبلی از توالی DNA هدف برای طراحی پرایمرها برای تقویت انتخابی دارد. این بدان معنی است که محققان باید دنباله خاصی در بالادست منطقه هدف در هر الگوی تک رشته ای را بدانند. بدون این اطلاعات، تقویت PCR نمی تواند انجام شود.
• پتانسیل خطا و جهش: مانند همه آنزیم ها، DNA پلیمرازهای مورد استفاده در PCR مستعد خطا در طول سنتز DNA هستند که منجر به جهش در قطعات تقویت شده می شود. این خطاها می تواند نادرستی در نتایج ایجاد کند و بر تحلیل یا تفسیر پایین دستی تأثیر بگذارد.
• خطرات آلودگی: PCR بسیار حساس است که هم یک مزیت و هم محدودیت است. حتی مقدار کمی از DNA آلوده، مانند واکنش های قبلی PCR یا منابع محیطی، می تواند تقویت شود و منجر به نتایج کاذب یا مبهم شود. برای به حداقل رساندن خطرات آلودگی، باید از پروتکل های آزمایشگاهی دقیق، از جمله اتاق های جداگانه برای آماده سازی معرف، تنظیم PCR و آنالیز پیروی کرد. باید از مقادیر یکبار مصرف و پیپتاتورهای یکبار مصرف استفاده شود و گردش کار یک طرفه باید حفظ شود.
• مهار توسط برخی مواد: PCR را می توان با حضور برخی مواد شیمیایی مانند اتانول، فنل، ایزوپروپانول، سدیم دودسیل سولفات (SDS)، غلظت بالای نمک و شلاتورها مهار کرد. این مواد ممکن است در نمونه وجود داشته باشند یا در طی فرآیند آزمایشی معرفی شوند که منجر به تقویت ناموفق یا غیربهینه شود.
• محدودیت های اندازه: حد بالایی برای اندازه DNA وجود دارد که می تواند به طور موثر با PCR تقویت شود. قطعات بزرگ DNA ممکن است به طور موثر تکثیر نشوند یا ممکن است به پروتکل های PCR اصلاح شده نیاز داشته باشند.
• زمان تجزیه و تحلیل طولانی تر: در حالی که واکنش PCR به خودی خود نسبتا سریع است، تجزیه و تحلیل و تشخیص محصولات PCR اغلب زمان بیشتری می برد. این می تواند شامل الکتروفورز ژل، توالی یابی DNA، یا تکنیک های دیگر برای تأیید و تجزیه و تحلیل DNA تقویت شده باشد. زمان اضافی مورد نیاز برای این مراحل باید در برنامه ریزی تجربی در نظر گرفته شود.
• مهار توسط نمونه‌های محیطی: نمونه‌های محیطی حاوی اسیدهای هیومیک، مانند نمونه‌های خاک یا آب، می‌توانند از تقویت PCR جلوگیری کرده و منجر به نتایج نادرست یا ناموفق شوند. ممکن است برای غلبه بر این محدودیت، روش‌های خالص‌سازی تخصصی یا پروتکل‌های جایگزین PCR مورد نیاز باشد.

آگاهی از این محدودیت ها برای محققان و پزشکانی که با PCR کار می کنند ضروری است. با درک این چالش ها، می توان اقدامات احتیاطی مناسب برای اطمینان از قابلیت اطمینان و دقت نتایج PCR در کاربردهای مختلف انجام داد.

کاربردهای واکنش زنجیره ای پلیمراز (PCR):

واکنش زنجیره ای پلیمراز (PCR) به دلیل تطبیق پذیری و حساسیت آن، انقلابی در زمینه های مختلف علم و پزشکی ایجاد کرده است. PCR و انواع پیشرفته آن چندین کاربرد را ممکن ساخته است که زمانی غیرممکن به نظر می رسید. در اینجا برخی از کاربردهای کلیدی PCR آورده شده است:

تشخیص عفونت: روش های PCR به طور گسترده در آزمایشگاه های بالینی برای تشخیص عفونت های ناشی از باکتری ها، ویروس ها، تک یاخته ها و قارچ ها استفاده می شود. این تکنیک ها تشخیص و تعیین کمیت عوامل عفونی خاص و حساس را ارائه می دهند.

تشخیص نقایص ژنتیکی: از سیستم های تشخیص مبتنی بر PCR برای شناسایی دقیق اختلالات ژنتیکی قبل از شروع بیماری و تایید وجود آنها پس از شروع استفاده می شود. PCR امکان تشخیص تغییرات ژنتیکی ارثی و جهش های ژنتیکی خود به خود را فراهم می کند.

تشخیص و پیش آگهی سرطان ها: رویکردهای مبتنی بر PCR می توانند ژن های مرتبط با سرطان را شناسایی کرده و الگوهای بیان آنها را تجزیه و تحلیل کنند. این به تعیین استعداد ژنتیکی برای انواع خاصی از سرطان، تایید نوع سرطان، پیش‌بینی پیش‌آگهی و هدایت تصمیمات درمانی کمک می‌کند.

فیلوژنتیک: تقویت PCR نشانگرهای فیلوژنتیک به طور معمول در تجزیه و تحلیل فیلوژنتیک برای شناسایی و طبقه بندی موجودات استفاده می شود. این به درک روابط تکاملی و تنوع زیستی کمک می کند.

باستان شناسی: تکنیک های PCR برای تقویت و بهبود کیفیت و کمیت DNA باستانی (aDNA) بازیابی شده از بقایای باستان شناسی استفاده می شود. این امکان تجزیه و تحلیل aDNA را برای مطالعه جمعیت های باستانی، تاریخ تکاملی و تنوع ژنتیکی فراهم می کند.

فناوری DNA نوترکیب: PCR در فناوری DNA نوترکیب برای تولید مولکول های DNA هیبریدی با دقت استفاده می شود. همچنین برای شبیه سازی DNA در ناقل های خاص برای بیان و تولید پروتئین استفاده می شود.

متاژنومیکس: PCR با متاژنومیکس برای شناسایی ژن های نادر و اعضای جوامع میکروبی ترکیب می شود. متاژنومیکس هدفمند ژنی امکان تشخیص گونه های نادر و ژن های کمیاب موجود در اکوسیستم های میکروبی پیچیده را فراهم می کند.

جهش زایی: رویکردهای مبتنی بر PCR معمولاً برای معرفی جهش در مکان های خاص در یک ژن استفاده می شود. این تکنیک به مطالعه نقش اسیدهای آمینه خاص در ساختار و عملکرد پروتئین ها کمک می کند.

پزشکی شخصی: فناوری‌های PCR نقش مهمی در فارماکوژنومیک دارند. نشانگرهای ژنتیکی که توسط PCR ردیابی می‌شوند به تعیین پاسخ‌های فردی به درمان‌ها، طراحی داروهای مناسب و تجویز دوزهای مؤثر دارو کمک می‌کنند.

علوم پزشکی قانونی: PCR در علوم پزشکی قانونی برای تکثیر نمونه های DNA به دست آمده از صحنه جرم استفاده می شود. حتی نمونه‌های DNA با کیفیت پایین و کمیت را می‌توان با استفاده از PCR به طور قابل اعتماد آنالیز کرد و به شناسایی و تحقیقات جنایی کمک کرد.

پروفایل DNA: روش های مبتنی بر PCR برای پروفایل DNA استفاده می شود که از ماهیت چندشکلی DNA بهره برداری می کند. این تکنیک ها به مطالعه جوامع بوم شناختی، فیلوژنی، ژنتیک جمعیت و ارائه اطلاعات ارزشمند در تحقیقات پزشکی قانونی کمک می کند.

پروفایل بیان ژن: PCR ترانس کریپتاز معکوس و PCR کمی (qPCR) به طور معمول برای تجزیه و تحلیل بیان ژن استفاده می شود. آنها به پروفیل کردن الگوهای بیان ژن و اعتبارسنجی پروفایل های رونوشت به دست آمده از طریق تکنیک هایی مانند ریزآرایه و RNA-seq کمک می کنند.

شناسایی گیاهان دارویی: بارکد DNA مبتنی بر PCR ابزاری سریع و دقیق برای شناسایی گونه های گیاهان دارویی است. این رویکرد در زمینه های مختلف از جمله پزشکی، اکولوژی و زیست شناسی حفاظتی برای شناسایی گونه های در حال انقراض و جدید استفاده می شود.

تشخیص ارگانیسم‌های اصلاح‌شده ژنتیکی (GMOs): تکنیک‌های PCR برای ردیابی حضور ارگانیسم‌های اصلاح‌شده ژنتیکی در غذا و خوراک استفاده می‌شود. این امر مقررات آنها را تضمین می کند و از حقوق مصرف کننده با ارائه روش های تشخیص قابل اعتماد و سریع محافظت می کند.

کاربردهای PCR گسترده است و با توسعه انواع و تکنیک های جدید همچنان در حال گسترش است. حساسیت، ویژگی و تطبیق پذیری این تکنیک، آن را به ابزاری ضروری در رشته های مختلف علمی، تحقیقات بالینی و پزشکی تشخیصی تبدیل کرده است.

عوامل موثر بر تقویت واکنش زنجیره ای پلیمراز (PCR):

حجم نمونه:

• به طور کلی، واکنش در حجم 20، 50 یا 100 میکرولیتر در لوله های میکروفیوژ 0/2 یا 0/5 میلی لیتر انجام می شود.
• حجم های بیشتر اجازه نمی دهد تعادل حرارتی کافی مخلوط واکنش برقرار شود.

DNA الگو:

• در طی PCR، عموماً از مقدار نانوگرم DNA پلاسمید یا میکروگرم DNA ژنومی استفاده می شود.
• مقادیر بالاتر DNA الگو می تواند منجر به مهار یا تقویت غیر اختصاصی شود.

پرایمرها:

• پرایمرها اولیگونوکلئوتیدهای مصنوعی هستند که بین 15 تا 30 باز هستند.
• برای PCR نیاز به پرایمر فوروارد و معکوس است. دمای ذوب (Tm) هر دو آغازگر یکسان است.
• انتهای 3 پرایمرها بیش از دو پایه مکمل یکدیگر ندارند، زیرا به شکل گیری پرایمر-دایمر کمک می کند.
• محتوای G+C پرایمرها از 40 تا 60 درصد متغیر است.
• غلظت های پایین پرایمرها منجر به عملکرد ضعیف محصول خاص و غلظت بالای پرایمرها ممکن است باعث تقویت غیر اختصاصی شود. غلظت بهینه پرایمرها بین 0/1 تا 1 میکرومولار است.

دئوکسی نوکلئوتید-تری فسفات:

• غلظت نهایی هر dNTP (dATP، dGTP، dCTP و dTTP) در یک واکنش تقویت استاندارد 200 میکرومولار است.
• حفظ غلظت dNTP بالاتر از Km تخمینی هر dNTP (10 تا 15 میکرومولار) برای بهترین ترکیب پایه مهم است.

بافر Taq DNA پلیمراز:

• بافر سنجش 10X شامل 100 میلی مولار Tris-Cl (pH 9.0)، حدود 500 میلی مولار کلرید پتاسیم، 15 میلی مولار MgCl و 0/1 درصد  ژلاتین w/v است.
• +Mg2 یک کوفاکتور مهم مورد نیاز برای فعالیت Taq DNA Polymerase است. غلظت کم منیزیم باعث عدم تقویت می شود و مقادیر زیاد ممکن است منجر به تولید محصولات ناخواسته شود.

Taq DNA پلیمراز:

این یک DNA پلیمراز 94 کیلو دالتون (کیلودالتون) مقاوم در برابر حرارت است. دمای مطلوب برای Taq DNA پلیمراز 72 درجه سانتی گراد است.
فعالیت اگزونوکلئاز 3 تا 5 وجود ندارد اما دارای فعالیت اگزونوکلئاز 5 تا 3 و فعالیت پلیمراز 5 تا 3 است.
برای بیشتر واکنش های تقویتی 1/5 تا 2 واحد از آنزیم توصیه می شود زیرا غلظت آنزیم بالاتر منجر به تقویت غیر اختصاصی می شود.

سوالات متداول

چگونه می توان نقش مهارکننده های PCR و اثرات آنها را کاهش داد؟

مهارکننده های PCR مانند اسیدهای هیومیک، پلی ساکاریدها یا برخی مواد شیمیایی می توانند از تکثیر DNA جلوگیری کنند. روش‌های پیش‌درمانی مانند خالص‌سازی DNA، رقیق‌سازی، یا افزودن آلبومین سرم گاوی (BSA) می‌تواند به کاهش اثرات آنها کمک کند.

چالش های رایج در تقویت PCR نواحی DNA غنی از GC یا غنی از AT چیست و چگونه می توان بر آنها غلبه کرد؟

مناطق غنی از GC می توانند ساختارهای ثانویه پایدار ایجاد کنند، در حالی که مناطق غنی از AT می توانند منجر به اتصال ضعیف پرایمر شوند. راه حل ها شامل تنظیم دمای دناتوراسیون، استفاده از DNA پلیمرازهای تخصصی، استفاده از DMSO یا بتائین به عنوان افزودنی، یا طراحی پرایمرهایی با نوکلئوتیدهای اصلاح شده (مانند اسیدهای نوکلئیک قفل شده یا اسیدهای نوکلئیک پپتیدی) است.

چگونه می توان از PCR برای تشخیص جهش های نادر یا اهداف کم کپی استفاده کرد؟

از تکنیک هایی مانند PCR تودرتو، PCR دیجیتال، یا PCR بلادرنگ با DNA پلیمرازهای با حساسیت بالا، طراحی پرایمر بهبود یافته و استفاده از پروب های اختصاصی آلل یا تجزیه و تحلیل ذوب با وضوح بالا استفاده کنید.

در تشخیص عفونت های میکروبی مبتنی بر PCR با چه چالش هایی مواجه هستیم و چه راهکارهایی را می توان برای غلبه بر آنها به کار گرفت؟

چالش ها شامل بار پاتوژن کم، مشکلات استخراج DNA، مهارکننده های PCR و تنوع ژنتیکی است. با بهینه سازی روش های استخراج DNA، استفاده از DNA پلیمرازهای تخصصی، استفاده از Multiplex PCR و طراحی پرایمرها/پروب هایی که مناطق حفاظت شده را هدف قرار می دهند، بر این چالش ها غلبه کنید.

نقش PCR در مهار همه گیری COVID-19 شامل چه مواردی است؟

PCR نقش مهمی در همه گیری COVID-19، به ویژه در تشخیص و نظارت بر ویروس SARS-CoV-2 ایفا کرده است. در اینجا برخی از جنبه های کلیدی نقش PCR وجود دارد:

• ابزار تشخیصی: آزمایش‌های مبتنی بر PCR، مانند واکنش زنجیره‌ای پلیمراز رونویسی معکوس (RT-PCR)، استاندارد طلایی برای تشخیص COVID-19 هستند. این آزمایش‌ها وجود RNA ویروسی SARS-CoV-2 را در نمونه‌های بیمار که معمولاً از سواب‌های نازوفارنکس جمع‌آوری می‌شوند، تشخیص می‌دهند. تست های PCR حساسیت و ویژگی بالایی دارند و امکان تشخیص دقیق ویروس را فراهم می کنند.
• تشخیص زودهنگام و مهار: آزمایش PCR تشخیص زودهنگام عفونت SARS-CoV-2 را حتی در افراد بدون علامت امکان پذیر می کند. این قابلیت برای شناسایی و جداسازی افراد آلوده برای جلوگیری از انتقال بیشتر و اجرای اقدامات بهداشت عمومی مناسب حیاتی است.
• غربالگری و نظارت: آزمایش PCR برای غربالگری انبوه و تلاش‌های نظارتی در محیط‌های مختلف، از جمله امکانات مراقبت‌های بهداشتی، محل‌های کار، فرودگاه‌ها و جوامع استفاده شده است. آزمایش منظم با استفاده از PCR به شناسایی و جداسازی سریع افراد آلوده کمک می‌کند، بنابراین زنجیره‌های انتقال را می‌شکند و انتشار ویروس را کنترل می‌کند.
• تشخیص انواع گونه: نظارت ژنومی مبتنی بر PCR در شناسایی و نظارت بر ظهور گونه های نگران کننده SARS-CoV-2 مفید بوده است. با تعیین توالی ژنوم ویروسی از نمونه‌های PCR مثبت، دانشمندان می‌توانند تکامل ویروس را ردیابی کنند، انواع جدید را شناسایی کرده و تاثیر بالقوه آن‌ها را بر قابلیت انتقال، شدت و اثربخشی واکسن ارزیابی کنند.
• ارزیابی اثربخشی واکسن: آزمایش PCR در آزمایش‌های بالینی و استقرار پس از واکسن برای ارزیابی اثربخشی واکسن‌های COVID-19 استفاده می‌شود. با مقایسه میزان عفونت بین گروه های واکسینه شده و دارونما، داده های PCR به تعیین اثربخشی واکسن کمک می کند و تصمیمات بهداشت عمومی را در مورد استراتژی های ایمن سازی آگاه می کند.
• ردیابی تماس: آزمایش PCR نقش حیاتی در تلاش های ردیابی تماس ایفا می کند. با شناسایی و آزمایش تماس های نزدیک موارد تایید شده، PCR به شناسایی ناقلان بدون علامت و شکستن زنجیره های انتقال با جداسازی سریع افراد آلوده کمک می کند.

در سایت National Human Genome Research Institute در مورد واکنش زنجیره ای پلیمراز (PCR) بیشتر بخوانید:

واکنش زنجیره ای پلیمراز (به اختصار PCR) یک تکنیک آزمایشگاهی برای تولید (تقویت) سریع میلیون ها تا میلیاردها نسخه از یک بخش خاص از DNA است که می تواند سپس با جزئیات بیشتری مورد مطالعه قرار گیرد. PCR شامل استفاده از قطعات کوتاه DNA مصنوعی به نام پرایمرها برای انتخاب بخشی از ژنوم برای تکثیر و سپس چندین دور سنتز DNA برای تکثیر آن بخش است.

مطالب مرتبط در متااورگانون: