NGS | توالی یابی نسل بعدی | Next-generation sequencing | توالی یابی با توان بالا | High-throughput sequencing
- چرا و با چه هدفی آزمایش NGS یا توالی یابی نسل بعدی درخواست می شود؟
- نمونه مورد نیاز برای آزمایش NGS یا توالی یابی نسل بعدی:
- مراحل انجام آزمایش NGS یا توالی یابی نسل بعدی:
- موارد استفاده از NGS یا توالی یابی نسل بعدی:
- مزایای NGS یا توالی یابی نسل بعدی:
- محدودیت های NGS یا توالی یابی نسل بعدی:
- مطالب مرتبط در متااورگانون:
- واکنش زنجیره ای پلیمراز (PCR) | Polymerase Chain Reaction
- آزمایش HLA typing | تست سازگاری بافتی | HLA Crossmatching
- آزمایش تعیین هویت | آزمایش رد ابوت | paternity | آزمایش پدر فرزندی
- آزمایش کاریوتایپ | آنالیز کروموزوم | سایتوژنتیک | Karyotype | chromosome analysis
- NIPT (آزمایش غربالگری غیرتهاجمی قبل از تولد) | سل فری | cffDNA | Cell-Free Fetal DNA
- آزمایش بیوپسی مایع | DNA تومور در گردش (ctDNA) | Liquid biopsy | سلول های تومور در گردش (CTC) | Circulating Tumor Cell Count
چرا و با چه هدفی آزمایش NGS یا توالی یابی نسل بعدی درخواست می شود؟
آزمایش توالی یابی نسل بعدی (NGS) برای اهداف گسترده ای در زمینه های علوم آزمایشگاهی پزشکی، ژنومیک و تشخیص مولکولی به دلیل توان عملیاتی بالا، سرعت و توانایی آن در تولید مقادیر انبوه داده های ژنتیکی درخواست می شود. برخی از دلایل کلیدی درخواست تست NGS عبارتند از:
- تشخیص بیماری های ژنتیکی: NGS برای شناسایی جهش های ژنتیکی مسئول بیماری ها و اختلالات ارثی مختلف استفاده می شود. این می تواند تغییرات تک نوکلئوتیدی، درج ها، حذف ها و تغییرات ساختاری بزرگتر در ژنوم را تشخیص دهد. این برای تشخیص بیماری هایی مانند فیبروز کیستیک، دیستروفی عضلانی و بسیاری از اختلالات ژنتیکی نادر بسیار مهم است.
- ژنومیک سرطان: NGS نقش حیاتی در درک اساس ژنتیکی سرطان دارد. این می تواند جهش های سوماتیک، بازآرایی های کروموزومی و تغییرات تعداد کپی در سلول های سرطانی را شناسایی کند. این اطلاعات به هدایت گزینه های درمانی شخصی و پیش بینی نتایج بیمار کمک می کند.
- فارماکوژنومیک: NGS برای تجزیه و تحلیل ساختار ژنتیکی بیمار برای پیش بینی پاسخ آنها به داروهای خاص استفاده می شود. این امر با تطبیق درمان‌های دارویی با مشخصات ژنتیکی افراد، کاهش خطر عوارض جانبی و بهبود اثربخشی درمان، امکان پزشکی شخصی‌سازی شده را فراهم می‌کند.
- غربالگری و تشخیص قبل از تولد: NGS می تواند DNA جنین را در خون مادر برای غربالگری ناهنجاری های ژنتیکی و اختلالات کروموزومی مانند سندرم داون تجزیه و تحلیل کند. در برخی موارد می توان از روش های تهاجمی مانند آمنیوسنتز اجتناب کرد و خطر را برای جنین کاهش داد.
- ژنومیک بیماری های عفونی: NGS برای تشخیص و شناسایی عوامل بیماری زا از جمله باکتری ها، ویروس ها و قارچ ها استفاده می شود. این می تواند به ردیابی شیوع بیماری، درک اساس ژنتیکی مقاومت دارویی و طراحی درمان های هدفمند کمک کند.
- تجزیه و تحلیل میکروبیوم: NGS برای مطالعه ترکیب و تنوع جوامع میکروبی در محیط های مختلف مانند روده انسان، خاک و آب استفاده می شود. این به درک نقش میکروبیوم ها در سلامت، بیماری و اکوسیستم کمک می کند.
- ژنومیک قانونی: NGS می تواند در تحقیقات پزشکی قانونی برای تجزیه و تحلیل شواهد DNA، شناسایی افراد و ایجاد روابط بین نمونه ها استفاده شود.
- زیست شناسی تکاملی و تنوع زیستی: NGS برای مطالعه تنوع ژنتیکی درون و بین گونه ها، کمک به درک روابط تکاملی و حفاظت از تنوع زیستی استفاده می شود.
- ژنومیک کشاورزی: NGS برای تجزیه و تحلیل ژنوم گیاهان و حیوانات، بهبود عملکرد محصول، مقاومت در برابر بیماری ها و برنامه های اصلاح نژاد دام استفاده می شود.
- تحقیق و کشف: NGS تحقیقات ژنومی در مقیاس بزرگ را امکان پذیر می کند و کشف ژن های جدید، عناصر تنظیمی و مسیرهای عملکردی را تسهیل می کند.
نمونه مورد نیاز برای آزمایش NGS یا توالی یابی نسل بعدی:
توالی یابی نسل بعدی (NGS) را می توان برای انواع مختلفی از نمونه ها اعمال کرد که امکان تجزیه و تحلیل ژنتیکی جامع را فراهم می کند. انتخاب نمونه به اهداف خاص آنالیز بستگی دارد. در اینجا برخی از نمونه های رایج مورد استفاده برای آزمایش NGS آورده شده است:
خون کامل: نمونه های خون، از جمله خون کامل یا سلول های تک هسته ای خون محیطی (PBMCs)، معمولاً برای تجزیه و تحلیل NGS استفاده می شوند. آنها می توانند برای کاربردهای مختلفی از جمله تشخیص بیماری های ژنتیکی، ژنومیک سرطان و فارماکوژنومیک استفاده شوند.
بافت تومور: بیوپسی تومور یا نمونه های بافت برداشته شده برای ژنومیک سرطان برای شناسایی جهش های ژنتیکی، تغییرات تعداد کپی و سایر تغییرات خاص سلول های سرطانی استفاده می شود.
بزاق: نمونه های بزاق را می توان به صورت غیر تهاجمی جمع آوری کرد و اغلب برای آزمایش های ژنتیکی، از جمله تجزیه و تحلیل اجداد، غربالگری ناقل و فارماکوژنومیک استفاده می شود.
سواب باکال: مشابه بزاق، سواب باکال برای جمع آوری سلول های گونه برای تجزیه و تحلیل DNA استفاده می شود. آنها معمولاً برای آزمایش ژنتیکی زمانی که جمع آوری خون چالش برانگیز است استفاده می شود.
نمونه گیری مایع آمنیوتیک یا پرزهای کوریونی (CVS): این نمونه ها برای آزمایش ژنتیکی قبل از تولد برای ارزیابی سلامت و وضعیت ژنتیکی جنین استفاده می شوند.
بافت جفت: نمونه جفت می تواند بینشی در مورد شرایط ژنتیکی موثر بر جنین در دوران بارداری ارائه دهد.
لاین های سلولی: لاین های سلولی ایجاد شده برای اهداف تحقیق و آزمایش استفاده می شود. آنها می توانند دستکاری ژنتیکی شوند و منبع تجدیدپذیری از مواد ژنتیکی را فراهم کنند.
بافت جامد: از بافت های جامد مختلف مانند کبد، کلیه و ماهیچه می توان برای تجزیه و تحلیل ژنتیکی استفاده کرد، به ویژه در مواردی که وضعیت ژنتیکی یک عضو خاص مرتبط است.
مایع مغزی نخاعی (CSF): نمونه های CSF را می توان در مواردی که مشکوک به اختلالات عصبی است استفاده کرد.
شاید این مطلب برای شما مفید باشد:
آزمایش آنالیز مایع مغزی نخاعی (CSF) | Spinal Fluid Analysis | Cerebrospinal Fluid
مو، ناخن و سایر مواد زیستی: در برخی موارد می توان از نمونه های غیر سنتی مانند مو و ناخن برای تجزیه و تحلیل DNA استفاده کرد.
توجه به این نکته مهم است که کیفیت و کمیت DNA یا RNA در نمونه می تواند بر موفقیت تجزیه و تحلیل NGS تأثیر بگذارد. جمع آوری، ذخیره سازی و جابجایی صحیح نمونه برای به دست آوردن نتایج دقیق و قابل اعتماد بسیار مهم است. علاوه بر این، پلتفرم‌های مختلف NGS ممکن است الزامات خاصی برای مواد ورودی داشته باشند، بنابراین پیروی از دستورالعمل‌های سازنده مهم است.
انتخاب نوع نمونه باید با اهداف تحقیقاتی یا بالینی خاص مطابقت داشته باشد و ملاحظاتی مانند سهولت جمع آوری نمونه، راحتی بیمار و نوع آنالیز انجام شده باید در نظر گرفته شود.
مراحل انجام آزمایش NGS یا توالی یابی نسل بعدی:
یک آزمایش معمولی NGS بدون توجه به فناوری ابزار مورد استفاده، شامل مراحل زیر است:
ساخت کتابخانه (Construct library):
بعد از نمونه برداری و استخراج DNA یا RNA و ساخت cDNA، باید یک “کتابخانه” از نمونه ایجاد شود. نمونه DNA (یا cDNA) به قطعات نسبتاً کوتاه دو رشته ای (100 تا 800 جفت باز) پردازش می شود. بسته به کاربرد، تکه تکه شدن DNA را می توان به روش های مختلفی از جمله برش فیزیکی، هضم آنزیمی و تقویت بر اساس PCR در مناطق ژنتیکی خاص انجام داد. سپس قطعات DNA حاصل به توالی‌های آداپتور مخصوص فناوری متصل می‌شوند و یک کتابخانه قطعه تشکیل می‌دهند.
این آداپتورها همچنین ممکن است یک “بارکد” مولکولی منحصر به فرد داشته باشند، بنابراین هر نمونه می تواند با یک توالی DNA منحصر به فرد برچسب گذاری شود. این اجازه می دهد تا چندین نمونه با هم مخلوط شده و توالی یابی شوند. به عنوان مثال، بارکدهای 1 تا 20 را می توان برای برچسب گذاری جداگانه 20 نمونه و سپس تجزیه و تحلیل آنها در یک اجرای توالی استفاده کرد. این رویکرد که «pooling» یا «multiplexing» نامیده می‌شود، در زمان و هزینه در طول آزمایش‌های توالی‌بندی و کنترل‌ها برای تغییرات گردش کار صرفه‌جویی می‌کند، زیرا نمونه‌های تلفیقی با هم پردازش می‌شوند.
علاوه بر کتابخانه های قطعات، دو روش تخصصی دیگر برای آماده سازی کتابخانه وجود دارد: کتابخانه های paired-end libraries و کتابخانه های mate-pair libraries.
کتابخانه های paired-end:
- کتابخانه های paired-end به کاربران اجازه می دهند قطعه DNA را از هر دو انتها توالی یابی کنند، به جای توالی یابی معمولی که فقط در یک جهت انجام می شود. کتابخانه‌های جفت شده مانند کتابخانه‌های قطعه معمولی ایجاد می‌شوند، اما دارای برچسب‌های آداپتور در هر دو انتهای درج DNA هستند که توالی‌یابی را از دو جهت امکان‌پذیر می‌سازد.
- این روش خوانش‌ها را آسان‌تر می‌کند و می‌تواند برای بهبود تشخیص بازآرایی‌های ژنومی، عناصر توالی مکرر، و همجوشی‌های ژن RNA یا واریانت‌های با هم استفاده شود. با این حال، پیشرفت در روش‌های آماده‌سازی کتابخانه مدرن و ابزارهای تجزیه و تحلیل، تشخیص این ویژگی‌ها را با توالی‌یابی تک جهتی نیز ممکن ساخته است.
کتابخانه‌های Mate-pair:
ایجاد کتابخانه‌های Mate-pair نسبت به کتابخانه‌های paired-end پیچیده‌تر است و شامل درج‌های DNA با اندازه بسیار بزرگتر (بیش از 2 کیلوبایت و حداکثر 30 کیلوبایت) است. توالی‌بندی کتابخانه‌های Mate-pair، دو خواندن ایجاد می‌کند که از یکدیگر دور هستند و در جهت مخالف هستند. با استفاده از اطلاعات فیزیکی مرتبط بین دو توالی خوانی، توالی یابی Mate-pair برای مونتاژ de novo، تشخیص انواع ساختاری بزرگ و شناسایی بازآرایی های پیچیده ژنومی مفید است.
تقویت کلونال کتابخانه (Clonal amplification):
قبل از توالی یابی، کتابخانه DNA باید به یک سطح جامد متصل شود و به صورت کلونیک تقویت شود تا سیگنال قابل شناسایی از هر هدف در طول توالی یابی افزایش یابد. در طول این فرآیند، هر مولکول DNA منحصر به فرد در کتابخانه به سطح یک مهره یا یک سلول جریانی متصل می شود و PCR برای ایجاد مجموعه ای از کلون های یکسان تقویت می شود. در مورد فناوری Ion Torrent، فرآیندی به نام “templating” برای افزودن مولکول های کتابخانه به مهره ها استفاده می شود.
توالی یابی کتابخانه (Sequence library):
تمام DNA موجود در کتابخانه به طور همزمان با استفاده از ابزار توالی یابی تعیین توالی می شود. اگرچه هر فناوری NGS منحصربه‌فرد است، اما همه آنها از نسخه‌ای از روش «توالی‌یابی با سنتز (sequencing by synthesis)» استفاده می‌کنند و پایه‌های جداگانه را در حالی که در امتداد یک رشته پلیمریزه رشد می‌کنند، می‌خوانند. این یک چرخه با مراحل مشترک است: سنتز پایه DNA بر روی DNA تک رشته ای، به دنبال آن شناسایی باز ترکیب شده، و سپس حذف واکنش دهنده ها برای شروع مجدد چرخه.
اکثر ابزارهای توالی یابی از تشخیص نوری برای تعیین ترکیب نوکلئوتید در طول سنتز DNA استفاده می کنند. ابزارهای Ion Torrent از تشخیص الکتریکی برای حس کردن آزاد شدن یون های هیدروژن استفاده می کنند، که به طور طبیعی زمانی اتفاق می افتد که نوکلئوتیدها در طول سنتز DNA ترکیب شوند.
تجزیه و تحلیل داده ها
هر آزمایش NGS مقادیر زیادی از داده‌های پیچیده متشکل از خواندن کوتاه DNA تولید می‌کند. اگرچه هر پلت‌فرم فناوری الگوریتم‌ها و ابزارهای تجزیه و تحلیل داده‌های خاص خود را دارد، اما آنها یک «pipeline» تحلیل مشابه دارند و از معیارهای رایج برای ارزیابی کیفیت مجموعه‌های داده NGS استفاده می‌کنند.
تجزیه و تحلیل را می توان به سه مرحله تجزیه و تحلیل اولیه، ثانویه و سوم تقسیم کرد.
- تجزیه و تحلیل اولیه پردازش سیگنال های خام از آشکارسازهای ابزار به داده های دیجیتالی یا تماس های پایه است. این داده های خام در طول هر چرخه توالی جمع آوری می شوند. خروجی تجزیه و تحلیل اولیه فایل‌هایی است که شامل فراخوان‌های پایه هستند که در خواندن‌های توالی (فایل‌های FASTQ) و امتیازهای کیفی مرتبط با آنها (Phred quality score) جمع‌آوری شده‌اند.
- تجزیه و تحلیل ثانویه شامل فیلتر خواندن و برش بر اساس کیفیت، و به دنبال آن alignment به ژنوم مرجع یا مجموعه ای از خوانده شده برای ژنوم های جدید، و در نهایت با فراخوانی متغیر است. خروجی اصلی یک فایل BAM است که حاوی خواندن های تراز شده است.
- تحلیل سوم چالش برانگیزترین مرحله است، زیرا شامل تفسیر نتایج و استخراج اطلاعات معنی دار از داده ها می شود.
به دلیل پیچیدگی داده های NGS و الگوریتم های مرتبط، تجزیه و تحلیل NGS معمولاً توسط متخصصان بیوانفورماتیک انجام می شود.
دستگاه های مختلف NGS یا توالی یابی نسل بعدی
موارد استفاده از NGS یا توالی یابی نسل بعدی:
فرصت های متعددی برای استفاده از NGS در عمل بالینی برای بهبود مراقبت از بیمار وجود دارد، از جمله:
NGS طیف وسیع‌تری از جهش‌ها را نسبت به توالی‌یابی سانگر ثبت می‌کند. طیف تغییرات DNA در ژنوم انسان شامل تغییرات پایه کوچک (جایگزینی)، درج و حذف DNA، حذف ژنومی بزرگ اگزون‌ها یا کل ژن‌ها و بازآرایی‌هایی مانند وارونگی و جابه‌جایی است. توالی یابی سنتی سنگر به کشف جانشین ها و درج ها و حذف های کوچک محدود می شود.
برای جهش‌های باقیمانده، سنجش‌های اختصاصی اغلب انجام می‌شوند، مانند هیبریداسیون فلورسانس در محل (FISH) در کاریوتایپینگ معمولی، یا میکرو آرایه‌های هیبریداسیون ژنومی مقایسه‌ای (CGH) برای تشخیص تغییرات تعداد کپی کروموزومی زیر میکروسکوپی مانند حذف‌های کوچک. با این حال، این داده‌ها را می‌توان مستقیماً از داده‌های توالی‌یابی NGS نیز استخراج کرد و نیاز به سنجش‌های اختصاصی را در حین جمع‌آوری طیف کامل تنوع ژنومی در یک آزمایش منفرد برطرف کرد.
تنها محدودیت‌ها در مناطقی هستند که به دلیل محتوای شدید گوانین/سیتوزین (GC) یا معماری تکراری، توالی ضعیفی دارند، به‌عنوان مثال، گسترش مکرر زمینه‌ای سندرم X شکننده یا بیماری هانتینگتون.
ژنوم ها را می توان بدون سوگیری (bias) مورد بررسی قرار داد. با این حال، NGS کاملاً غیرانتخابی است و برای بررسی ژنوم یا اگزوم کامل برای کشف جهش‌های کاملاً جدید و ژن‌های عامل بیماری استفاده می‌شود.
در اطفال، می توان از این برای کشف اساس ژنتیکی سندرم های غیر قابل توضیح استفاده کرد. به عنوان مثال، یک پروژه سراسری به نام رمزگشایی از اختلالات رشدی که در موسسه Wellcome Trust Sanger با همکاری خدمات ژنتیک بالینی NHS اجرا می‌شود، با هدف کشف پایه‌های ژنتیکی تاخیر رشد غیرقابل توضیح با توالی‌یابی کودکان مبتلا و والدین آنها برای کشف انواع موتاسیون های جدید، تلاش می‌کند. پیوند این داده های مولکولی با اطلاعات فنوتیپی بالینی دقیق در شناسایی ژن های جدید جهش یافته در کودکان مبتلا با ویژگی های بالینی مشابه موفق بوده است.
افزایش حساسیت NGS امکان تشخیص جهش های موزاییکی را فراهم می کند. توالی یابی مویرگی ممکن است این گونه جهش ها را از دست بدهد، زیرا آنها اغلب با ظرافتی کمتر از حساسیت فناوری، ظاهر می شوند. توالی یابی NGS خوانش بسیار حساس تری را فراهم می کند و بنابراین می تواند برای شناسایی انواعی که فقط در چند درصد از سلول ها قرار دارند، از جمله تغییرات موزاییکی استفاده شود.
علاوه بر این، حساسیت توالی یابی NGS را می توان به سادگی با افزایش عمق توالی افزایش داد. این باعث شده است که NGS برای تحقیقات بسیار حساس مانند بازجویی از DNA جنین از خون مادر یا ردیابی سطوح سلول های تومور از گردش خون بیماران سرطانی استفاده شود.
NGS در میکروبیولوژی:
در میکروبیولوژی، توالی‌یابی نسل بعدی (NGS) به عنوان یک ابزار قدرتمند با کاربردهای متنوع ظاهر شده است که به طور قابل‌توجهی بر درک ما از جوامع میکروبی، تنوع ژنتیکی و تعامل آنها با میزبان و محیط تأثیر می‌گذارد. کاربردهای اصلی NGS در میکروبیولوژی عبارتند از:
- ژنومیک میکروبی: NGS امکان توالی یابی سریع و جامع ژنوم های میکروبی را فراهم می کند. این منجر به شناسایی ژنوم های باکتریایی، ویروسی، قارچی و میکروارگانیسم های باستانی متعددی شده است. ژنومیک میکروبی محققان را قادر می سازد تا ترکیب ژنتیکی پاتوژن ها را مطالعه کنند، عوامل بیماری زای آنها را درک کنند و مکانیسم های مقاومت دارویی را کشف کنند.
- متاژنومیکس: متاژنومیکس شامل تعیین توالی و تجزیه و تحلیل DNA است که مستقیماً از نمونه های محیطی حاوی جمعیت های مختلف میکروبی استخراج می شود. NGS امکان اکتشاف جوامع میکروبی را در اکوسیستم های مختلف مانند خاک، آب و روده انسان فراهم می کند. این رویکرد بینشی در مورد ترکیب، تنوع و پتانسیل عملکردی این جوامع ارائه می دهد.
- مطالعات میکروبیوم: میکروبیوم انسان، متشکل از تریلیون ها میکروارگانیسم ساکن بدن ما، تأثیر عمیقی بر سلامت و بیماری دارد. NGS مطالعه میکروبیوم انسان را تسهیل می کند و به محققان این امکان را می دهد تا گونه های مختلف میکروبی موجود در نقاط مختلف بدن را شناسایی و مشخص کنند. این دانش برای درک نقش میکروبیوم در شرایطی مانند چاقی، بیماری التهابی روده و موارد دیگر ضروری است.
- پایش مقاومت ضد میکروبی (AMR): NGS برای نظارت بر ظهور و گسترش سویه‌های باکتری مقاوم به ضد میکروبی بسیار ارزشمند است. با تعیین توالی ژنوم های باکتریایی، محققان می توانند نشانگرهای ژنتیکی مرتبط با مقاومت به آنتی بیوتیک ها را شناسایی کنند. این اطلاعات تصمیمات مراقبت های بهداشتی را راهنمایی می کند و استراتژی هایی را برای مبارزه با مشکل رو به رشد AMR ارائه می دهد.
- تنوع و تکامل میکروبی: NGS با آشکار کردن تغییرات ژنتیکی و روابط تکاملی بین میکروارگانیسم‌ها، مطالعه تکامل میکروبی را امکان‌پذیر می‌سازد. ژنومیکس مقایسه ای به محققان کمک می کند تا منشا پاتوژن ها را ردیابی کنند، تکامل آنها را در طول زمان درک کنند و رفتار آینده آنها را پیش بینی کنند.
- تشخیص بیماری های عفونی: NGS انقلابی در تشخیص بیماری های عفونی ایجاد کرده است. با تعیین توالی ژنوم پاتوژن ها به طور مستقیم از نمونه های بیمار، پزشکان می توانند به سرعت و با دقت عوامل ایجاد کننده عفونت را شناسایی کنند. این به ویژه در موارد عفونت ناشناخته یا غیر معمول مفید است.
- بررسی فیلوژنتیک و تاکسونومی: داده های NGS به اصلاح طبقه بندی میکروبی و روابط فیلوژنتیک کمک می کند. حتی در مواردی که روش‌های سنتی کوتاهی می‌کنند، به طبقه‌بندی و دسته‌بندی دقیق میکروارگانیسم‌ها کمک می‌کند.
- ژنومیک عملکردی: NGS به محققان این امکان را می دهد تا عناصر عملکردی ژنوم های میکروبی مانند مناطق کد کننده، RNA های غیر کد کننده و عناصر تنظیم کننده را تجزیه و تحلیل کنند. این بینشی را در مورد چگونگی سازگاری میکروارگانیسم ها با محیط های مختلف و تعامل با میزبان ها ارائه می دهد.
- متاژنومیکس ویروسی: NGS برای مطالعه تنوع ویروسی در محیط های مختلف، از جمله نمونه های بالینی و نمونه های محیطی استفاده می شود. متاژنومیکس ویروسی به کشف ویروس های جدید، درک تکامل ویروسی و شناسایی منابع بالقوه شیوع ویروسی کمک می کند.
ماهیت جامع و پربازده NGS، میکروبیولوژی را متحول کرده است، و محققان را قادر می سازد تا عمیق تر در دنیای میکروبی کاوش کنند، بینش های بدیع را کشف کنند و سهم قابل توجهی در زمینه هایی مانند پزشکی، کشاورزی، علوم محیطی و غیره داشته باشند.
NGS در انکولوژی:
فرض اساسی ژنومیک سرطان این است که سرطان ناشی از جهش‌های اکتسابی سوماتیک است و در نتیجه یک بیماری ژنومی است. اگرچه توالی یابی سرطان مبتنی بر روش مویرگی بیش از یک دهه ادامه داشته است، این تحقیقات به نمونه های نسبتا کمی و تعداد کمی از ژن های کاندید محدود شد. با ظهور NGS، اکنون می توان ژنوم های سرطان را به طور سیستماتیک به طور کامل مطالعه کرد، تلاشی که از طریق چندین پروژه ژنوم سرطان در مقیاس بزرگ در سراسر جهان، از جمله پروژه اختصاصی ژنوم سرطان کودکان در حال انجام است.
مزایایی از جمله تشخیص دقیق تر و طبقه بندی بیماری، پیش آگهی دقیق تر، و به طور بالقوه شناسایی جهش های علّی «قابل مصرف دارو». بنابراین، توالی یابی سرطان فردی ممکن است مبنای مدیریت شخصی سرطان را فراهم کند. در حال حاضر پروژه‌های آزمایشی با استفاده از NGS ژنوم‌های سرطان در عمل بالینی در حال انجام است، که عمدتاً با هدف شناسایی جهش‌ها در تومورهایی که می‌توانند توسط داروهای خاص جهش مورد هدف قرار گیرند، انجام می‌شود.
- پروفایل ژنومیک سرطان: NGS اجازه می دهد تا پروفایل ژنومی جامع تومورها را شناسایی کند و امکان شناسایی تغییرات ژنتیکی را فراهم می کند که باعث رشد سرطان می شود. این اطلاعات به انکولوژیست‌ها کمک می‌کند تا ساختار ژنتیکی منحصربه‌فرد تومور بیمار را درک کنند و استراتژی‌های درمان را بر اساس آن تنظیم کنند.
- پزشکی دقیق و درمان هدفمند: داده های NGS انتخاب درمان های هدفمند را راهنمایی می کند. با شناسایی جهش‌ها، تغییرات و امضاهای مولکولی خاص در تومور بیمار، انکولوژیست‌ها می‌توانند بیماران را با درمان‌هایی مطابقت دهند که محرک‌های ژنتیکی اصلی را هدف قرار می‌دهند. این رویکرد کارایی درمان را به حداکثر می رساند و در عین حال عوارض جانبی را به حداقل می رساند.
- تحلیل ناهمگونی تومور: NGS ناهمگنی درون تومورها را نشان می‌دهد، جایی که سلول‌های مختلف ممکن است تغییرات ژنتیکی مشخصی را در خود جای دهند. درک ناهمگنی تومور برای طراحی برنامه‌های درمانی مؤثر که به زیرجمعیت‌های مختلف سلول‌های سرطانی رسیدگی می‌کند و از مقاومت جلوگیری می‌کند، حیاتی است.
- تشخیص حداقل بیماری باقیمانده (MRD): NGS می تواند حداقل بیماری باقیمانده (MRD) را پس از درمان تشخیص دهد. با تعیین توالی نمونه های بیمار پس از درمان، انکولوژیست ها می توانند حتی مقادیر کمی از سلول های سرطانی را که ممکن است نشان دهنده عود احتمالی باشد، شناسایی کنند. این رویکرد نظارت را بهبود می بخشد و به تصمیم گیری در مورد درمان کمک می کند.
- بیوپسی مایع: بیوپسی مایع شامل تجزیه و تحلیل مواد ژنتیکی مشتق شده از تومور، مانند DNA در گردش تومور (ctDNA) یا سلول های تومور در گردش (CTCs) از خون بیمار است. بیوپسی های مایع مبتنی بر NGS روشی غیر تهاجمی برای نظارت بر پاسخ درمانی، تشخیص عود زودهنگام و ارزیابی تکامل تومورها در طول زمان ارائه می دهد.
- ایمونوژنومیک سرطان: NGS امکان مطالعه ریزمحیط تومور و تعامل بین تومورها و سیستم ایمنی را فراهم می کند. این دانش با شناسایی نشانگرهای زیستی مرتبط با پاسخ، توسعه ایمونوتراپی‌ها، مانند مهارکننده‌های ایمن‌پوینت را نشان می‌دهد.
- ارزیابی خطر سرطان ارثی: NGS می تواند جهش های مولد را که افراد را مستعد ابتلا به سرطان های خاص می کند، شناسایی کند. این برای ارزیابی خطرات سرطان ارثی و راهنمایی اقدامات پیشگیرانه برای بیماران و خانواده های آنها بسیار مهم است.
- کشف بیومارکرهای سرطان: NGS کشف بیومارکرهای سرطانی جدیدی را تسهیل می کند که می توانند به تشخیص زودهنگام، پیش آگهی و پیش بینی درمان کمک کنند. با تجزیه و تحلیل مجموعه داده های بزرگ، محققان می توانند امضاهای ژنتیکی مرتبط با انواع خاص سرطان را شناسایی کنند.
مزایای NGS یا توالی یابی نسل بعدی:
توالی یابی نسل بعدی (NGS) یک تغییر پارادایم در تحقیقات ژنومیک، تشخیص پزشکی و زمینه های مختلف علمی ایجاد کرده است. مزایای آن انقلابی در توانایی ما برای تجزیه و تحلیل DNA، RNA و سایر مولکول های بیولوژیکی ایجاد کرده است. در اینجا برخی از مزایای کلیدی NGS وجود دارد:
- بازدهی بالا: پلتفرم‌های NGS می‌توانند به طور همزمان میلیون‌ها قطعه DNA را توالی یابی کنند و تجزیه و تحلیل اطلاعات ژنتیکی پیچیده را به سرعت و در مقیاسی که قبلاً دست نیافتنی بود امکان‌پذیر می‌سازد.
- سرعت و کارایی: NGS در مقایسه با روش‌های سنتی توالی‌یابی Sanger می‌تواند مقادیر زیادی داده را در مدت زمان نسبتاً کوتاهی تولید کند. این سرعت به ویژه برای تحقیقات حساس به زمان و کاربردهای بالینی مفید است.
- تولید جامع داده ها: NGS بینش جامعی در مورد ژنوم ها، رونوشت ها و اپی ژنوم ها ارائه می دهد. این امکان را برای تجزیه و تحلیل همزمان عناصر ژنتیکی مختلف، از جمله مناطق کد کننده و غیر کد کننده، جهش ها و تغییرات ساختاری فراهم می کند.
- توالی De Novo: روش NGS تعیین توالی ژنوم ها را بدون نیاز به ژنوم مرجع امکان پذیر می کند. این برای مطالعه ارگانیسم‌های غیرمدل یا شناسایی انواع ژنتیکی جدید در نمونه‌های پیچیده ارزشمند است.
- تشخیص انواع نادر: NGS می تواند انواع ژنتیکی نادری را که ممکن است پیامدهای قابل توجهی برای حساسیت به بیماری، پاسخ دارویی و سایر صفات داشته باشند، شناسایی کند.
- پزشکی شخصی: NGS شناسایی تغییرات ژنتیکی فردی را تسهیل می کند و برنامه های درمانی شخصی را بر اساس مشخصات ژنتیکی بیمار امکان پذیر می کند. این امر به ویژه برای انکولوژی و فارماکوژنومیک مرتبط است.
- رونویسی و پروفایل بیان ژن: NGS امکان تعیین کمی سطح بیان ژن در کل رونوشت را فراهم می کند. این بینش برای درک فرآیندهای سلولی، مکانیسم های بیماری، و شناسایی اهداف درمانی بالقوه بسیار مهم است.
- بینش اپی ژنتیک: NGS می تواند تغییرات اپی ژنتیکی مانند متیلاسیون DNA و تغییرات هیستون را شناسایی کند و درک عمیق تری از تنظیم ژن و تمایز سلولی ارائه دهد.
- متاژنومیکس و تجزیه و تحلیل میکروبیوم: NGS امکان مطالعه جوامع میکروبی پیچیده و پتانسیل عملکردی آنها را در محیط های مختلف، از جمله میکروبیوم انسانی، فراهم می کند.
- ژنومیک سرطان و انکولوژی دقیق: NGS جهش های محرک، نشانگرهای زیستی و اهداف درمانی را در ژنوم سرطان شناسایی می کند، تصمیمات درمانی را هدایت می کند و نتایج بیمار را بهبود می بخشد.
- مطالعات تکاملی: داده های NGS به مطالعه روابط تکاملی، ژنتیک جمعیت و سازگاری گونه ها در طول زمان کمک می کند.
- تحقیق و تشخیص بیماری: NGS کشف عوامل ژنتیکی زمینه‌ساز بیماری‌های مختلف را تسریع می‌کند و امکان تشخیص زودهنگام، پیش‌آگهی و درمان‌های هدفمند را فراهم می‌کند.
- کاهش هزینه: در حالی که NGS در ابتدا گران بود، پیشرفت های مستمر به طور قابل توجهی هزینه ها را کاهش داده است و آن را برای طیف وسیع تری از محققان و پزشکان قابل دسترس تر کرده است.
- ادغام و تجزیه و تحلیل داده ها: داده های NGS را می توان با سایر داده های omics مانند پروتئومیکس و متابولومیک ادغام کرد تا درک جامعی از سیستم های بیولوژیکی ارائه دهد.
- کشف نشانگرهای زیستی جدید: NGS کشف بیومارکرهای جدیدی را تسهیل می کند که می توانند برای تشخیص بیماری، پیش آگهی و نظارت بر پاسخ درمانی استفاده شوند.
مزایای NGS تحقیقات و عملکرد بالینی را در رشته های مختلف متحول کرده است و به پیشرفت هایی در درک ژنتیک، مکانیسم های بیماری و مراقبت های بهداشتی شخصی کمک کرده است.
محدودیت های NGS یا توالی یابی نسل بعدی:
نقطه ضعف اصلی NGS در محیط بالینی، قرار دادن زیرساخت های مورد نیاز، و همچنین تخصص پرسنل مورد نیاز برای تجزیه و تحلیل جامع و تفسیر داده های بعدی است. علاوه بر این، حجم داده ها باید به طرز ماهرانه ای مدیریت شود تا اطلاعات مهم بالینی در یک رابط واضح و قوی استخراج شود. هزینه واقعی توالی NGS نسبت به فبل بسیار کمتر شده است. به عنوان مثال، یک پلت فرم پیشرفته NGS می تواند تقریباً 15000000 خواندن را با حدود 1000 پوند ایجاد کند، در حالی که یک خواندن سانگر معمولاً کمتر از 1 پوند هزینه دارد.
با این حال، برای مقرون به صرفه ساختن NGS، باید دسته های بزرگی از نمونه ها را اجرا کرد که ممکن است به تمرکز فرامنطقه ای نیاز داشته باشند. پس از سرمایه گذاری اولیه، ظرفیت یک مرکز NGS می تواند خدماتی را در مقیاس ملی ارائه دهد که احتمالاً علاوه بر بهبود در مراقبت از بیمار، مزایای اقتصادی نیز ارائه می دهد.
با وجود مزایای متعدد، توالی‌یابی نسل بعدی (NGS) همچنین دارای محدودیت‌هایی است که محققان و پزشکان باید هنگام استفاده از این فناوری در نظر بگیرند. در اینجا برخی از محدودیت های کلیدی NGS آورده شده است:
- نرخ خطا: پلتفرم‌های NGS می‌توانند در طول توالی‌یابی خطا ایجاد کنند، که می‌تواند منجر به عدم دقت در داده‌های حاصل شود. اگرچه دقت توالی یابی در طول زمان بهبود یافته است، اما همچنان ممکن است خطاها رخ دهد، به ویژه در مناطقی با محتوای GC بالا یا پایین، توالی های تکراری، یا در طول تقویت PCR.
- تغییر طول خواندن: طول خواندن (read lengths) تولید شده توسط پلت فرم های NGS می تواند متفاوت باشد. طول خواندن کوتاه‌تر می‌تواند جمع‌آوری دقیق ژنوم‌ها یا تجزیه و تحلیل بخش‌های طولانی DNA تکراری را چالش برانگیز کند، که می‌تواند برای کاربردهای خاص حیاتی باشد.
- پیچیدگی تجزیه و تحلیل داده ها: NGS حجم عظیمی از داده ها را تولید می کند که به ابزارهای پیچیده بیوانفورماتیک و منابع محاسباتی برای تجزیه و تحلیل نیاز دارند. تفسیر داده ها می تواند پیچیده باشد و خطا در تجزیه و تحلیل می تواند منجر به تفسیر نادرست نتایج شود.
- آلودگی نمونه و آلودگی متقاطع: آلودگی نمونه‌ها، چه در حین جمع‌آوری، جابجایی یا پردازش، می‌تواند منجر به نتایج نادرست شود. آلودگی متقاطع بین نمونه ها نیز می تواند در فضاهای آزمایشگاهی مشترک رخ دهد که بر دقت داده ها تأثیر می گذارد.
- هزینه و توان عملیاتی: در حالی که NGS در طول زمان مقرون به صرفه تر شده است، هنوز هم می تواند گران باشد، به ویژه برای پروژه های در مقیاس بزرگ. هزینه می تواند دسترسی به آن را برای برخی از محققان و موسسات محدود کند.
- تخصص بیوانفورماتیک مورد نیاز: تجزیه و تحلیل داده های NGS به مهارت های تخصصی بیوانفورماتیک نیاز دارد. محققان و پزشکان باید در استفاده از ابزارهای نرم افزاری مختلف و خطوط لوله برای استخراج بینش معنادار از داده های توالی یابی خام مهارت داشته باشند.
- ذخیره سازی و مدیریت داده ها: NGS حجم داده قابل توجهی را تولید می کند که به منابع ذخیره سازی و مدیریت داده قابل توجهی نیاز دارد. ذخیره، سازماندهی و به اشتراک گذاری این داده ها می تواند چالش برانگیز باشد.
- تشخیص تنوع شماره کپی: تشخیص تغییرات تعداد کپی (CNVs) با دقت از داده‌های NGS به دلیل مسائلی مانند سوگیری GC، تنوع عمق خواندن و محدودیت‌ها در حل CNV در مناطق تکراری می‌تواند چالش برانگیز باشد.
- توالی های هموپلیمر طولانی: پلتفرم‌های NGS می‌توانند با حل دقیق توالی‌های طولانی هموپلیمر مبارزه کنند که منجر به خطاهای بالقوه در تفسیر توالی می‌شود.
- تغییرات اپی ژنتیکی: در حالی که NGS می تواند بینشی در مورد متیلاسیون DNA و سایر تغییرات اپی ژنتیکی ارائه دهد، روش های توالی یابی اختصاصی اغلب برای تجزیه و تحلیل جامع اپی ژنومیک مورد نیاز است.
- چالش های اعتبارسنجی: اعتبارسنجی یافته‌های NGS، به‌ویژه برای کاربردهای بالینی، می‌تواند زمان‌بر باشد و به تکنیک‌های تجربی بیشتری نیاز دارد.
محققان و پزشکان باید از این محدودیت‌ها آگاه باشند و هنگام طراحی آزمایش‌ها، تجزیه و تحلیل داده‌ها و نتیجه‌گیری بر اساس نتایج NGS به دقت تأثیر آنها را در نظر بگیرند. علیرغم این محدودیت ها، NGS یک فناوری تحول آفرین با پتانسیل بسیار زیاد برای پیشرفت در زمینه های مختلف علم و پزشکی است.
در سایت Illumina در مورد توالی‌یابی نسل بعدی (NGS) بیشتر بخوانید:
توالی‌یابی نسل بعدی (NGS) یک فناوری توالی‌یابی موازی گسترده است که توان عملیاتی، مقیاس‌پذیری و سرعت بسیار بالایی را ارائه می‌دهد.این فناوری برای تعیین ترتیب نوکلئوتیدها در کل ژنوم یا مناطق هدف DNA یا RNA استفاده می شود.NGS علوم بیولوژیکی را متحول کرده است و به آزمایشگاه‌ها اجازه می‌دهد کاربردهای متنوعی را انجام دهند و سیستم‌های بیولوژیکی را در سطحی که قبلاً ممکن نبوده مطالعه کنند.
مطالب مرتبط در متااورگانون:
شاید این مطلب برای شما مفید باشد:
واکنش زنجیره ای پلیمراز (PCR) | Polymerase Chain Reaction
شاید این مطلب برای شما مفید باشد:
آزمایش HLA typing | تست سازگاری بافتی | HLA Crossmatching
شاید این مطلب برای شما مفید باشد:
آزمایش تعیین هویت | آزمایش رد ابوت | paternity | آزمایش پدر فرزندی
شاید این مطلب برای شما مفید باشد:
آزمایش کاریوتایپ | آنالیز کروموزوم | سایتوژنتیک | Karyotype | chromosome analysis
شاید این مطلب برای شما مفید باشد:
NIPT (آزمایش غربالگری غیرتهاجمی قبل از تولد) | سل فری | cffDNA | Cell-Free Fetal DNA
شاید این مطلب برای شما مفید باشد:
آزمایش بیوپسی مایع | DNA تومور در گردش (ctDNA) | Liquid biopsy | سلول های تومور در گردش (CTC) | Circulating Tumor Cell Count
مورد تایید و بازبینی شده توسط:
منابع مقاله
Ahmadian, A.; Svahn, H.; Massively Parallel. Sequencing Platforms using Lab on a Chip Technologies. Lab Chip, 11, 2653 – 2655 (2011).
Balasubramanian, S.; Decoding Genomes at High Speed: Implications for Science and Medicine. Angew. Chem Int. Ed. 50, 12406-12410 (2011).
Balasubramanian, S.; Sequencing Nucleic Acids: from Chemistry to Medicine. Chem. Commun. 47, 7281 – 7286 (2011).
Chen, F.; Dong, M.; Ge, M.; Zhu, L.; Ren, L.; Liu, G.; Mu, R.; The History and Advances of Reversible Terminators Used in New Generations of Sequencing Technology. Gen. Pro. Bio. 11, 34-40 (2013).
Mardis, E.; Next-Generation DNA Sequencing Methods. Annu. Rev. Genomics Hum. Genet. 9, 387 – 402 (2008).
Mardis, E.; Next-Generation DNA Sequencing Platforms. Annu. Rev. Anal. Chem. 6, 287-303 (2013).
Shendure, J.; Ji, H.; Next-Generation DNA Sequencing. Nat. Biotech. 26, 10 1135-1144 (2008).
