آزمایش متیلاسیون | methylation test

دکتر فرزاد باباخانی
آخرین بروزرسانی
13 بهمن 1402
آخرین بروزرسانی
13 بهمن 1402
آزمایش متیلاسیون | methylation test

اصطلاح آزمایش متیلاسیون (methylation) می تواند به آزمایش های مختلفی اشاره داشته باشد که برای ارزیابی الگوهای متیلاسیون DNA استفاده می شود که نقش مهمی در تنظیم بیان ژن ایفا می کند. متیلاسیون یک تغییر شیمیایی DNA است که شامل افزودن یک گروه متیل به یک پایه سیتوزین است که اغلب در سایت‌های CpG (مناطقی که سیتوزین توسط گوانین دنبال می‌شود) رخ می‌دهد. الگوهای متیلاسیون نابجای DNA با بیماری های مختلفی از جمله سرطان و اختلالات عصبی مرتبط است.

چرا آزمایش متیلاسیون (methylation test) درخواست می شود؟

آزمایش متیلاسیون (methylation test) استفاده های بالینی قابل توجهی دارد، به ویژه در زمینه تشخیص مولکولی و پزشکی شخصی. اهمیت بالینی آزمایش متیلاسیون بسته به زمینه متفاوت است، اما در اینجا برخی از زمینه‌های کلیدی که معمولاً آزمایش متیلاسیون در آنها اعمال می‌شود، آورده شده است:

  • تشخیص سرطان: الگوهای متیلاسیون DNA نابجا اغلب در سلول های سرطانی مشاهده می شود. آزمایش‌ متیلاسیون را می‌توان برای شناسایی ژن‌های خاص با وضعیت متیلاسیون تغییریافته مورد استفاده قرار داد و به عنوان نشانگرهای زیستی بالقوه برای انواع مختلف سرطان عمل می‌کند. آزمایش متیلاسیون ممکن است به تشخیص زودهنگام برخی سرطان ها کمک کند، زیرا الگوهای متیلاسیون غیرطبیعی می تواند در مراحل پیش سرطانی رخ دهد.
  • اطلاعات پیش آگهی در مورد سرطان: وضعیت متیلاسیون می تواند اطلاعات پیش آگهی ارائه دهد و به پیش بینی تهاجمی تومورها و نتایج بیمار کمک کند.
  • درمان اپی ژنتیک: درک وضعیت متیلاسیون ژن های خاص می تواند استفاده از درمان های اپی ژنتیکی را راهنمایی کند، مانند داروهایی که متیلاسیون DNA یا تغییرات هیستون را هدف قرار می دهند.
  • اختلالات عصبی: آزمایش متیلاسیون را می توان برای شناسایی تغییرات اپی ژنتیک مرتبط با اختلالات عصبی از جمله بیماری آلزایمر و پارکینسون استفاده کرد. تحقیقات برای شناسایی الگوهای متیلاسیون مرتبط با بیماری های عصبی در حال انجام است و ممکن است نشانگرهای تشخیص زودهنگام ظاهر شوند.
  • اختلالات ژنتیکی: آزمایش متیلاسیون در تشخیص اختلالات Imprinting، در مواردی که ناهنجاری هایی در الگوهای متیلاسیون DNA خاص والد منشاء وجود دارد، بسیار مهم است. تست های متیلاسیون در مشاوره ژنتیک برای ارائه اطلاعات در مورد خطر انتقال بیماری های ژنتیکی خاص به فرزندان استفاده می شود.
  • پزشکی تولید مثل: تست های متیلاسیون، مانند تست تورم هیپواسموتیک، می تواند برای ارزیابی یکپارچگی غشای اسپرم، ارائه بینشی در مورد باروری مردان استفاده شود. درک عوامل اپی ژنتیک، از جمله متیلاسیون DNA، می تواند در پزشکی باروری و فناوری های کمک باروری مرتبط باشد.

توجه به این نکته مهم است که تفسیر بالینی نتایج آزمایش متیلاسیون (methylation) نیاز به تخصص دارد و تصمیمات مربوط به مراقبت از بیمار باید توسط متخصصان ژنتیک گرفته شود. همانطور که زمینه اپی ژنتیک به تکامل خود ادامه می دهد، آزمایش های متیلاسیون احتمالا نقش مهمی را در پزشکی دقیق و توسعه درمان های هدفمند ایفا می کنند.

نمونه مورد نیاز برای آزمایش متیلاسیون (methylation test):

آزمایش متیلاسیون (methylation) را می توان بر روی نمونه های بیولوژیکی مختلف انجام داد و انتخاب نمونه اغلب به تحقیق یا سؤال بالینی خاص و همچنین دسترسی به بافت یا مایع بستگی دارد. در اینجا چند نمونه بیولوژیکی رایج مورد استفاده برای آزمایش متیلاسیون آورده شده است:

  • خون محیطی: DNA استخراج شده از لکوسیت های خون محیطی معمولاً برای تجزیه و تحلیل متیلاسیون استفاده می شود. این یک نمونه غیر تهاجمی و به راحتی در دسترس است. از لوله با درب بنفش حاوی EDTA استفاده می شود
  • بیوپسی تومور: برای مطالعات متیلاسیون مرتبط با سرطان، بافت تومور به دست آمده از طریق بیوپسی یا برداشتن جراحی اغلب برای درک وضعیت متیلاسیون ژن های خاص در سلول های سرطانی تجزیه و تحلیل می شود.
  • نمونه های بزاق: بزاق حاوی سلول هایی با DNA است و می تواند منبع مناسب و غیر تهاجمی برای تجزیه و تحلیل متیلاسیون باشد، به ویژه در مطالعات تحقیقاتی یا هنگام جمع آوری نمونه از افراد با مشکل در تهیه نمونه خون.
  • نمونه های منی: در پزشکی باروری، نمونه های منی ممکن است از نظر الگوهای متیلاسیون تجزیه و تحلیل شوند، به ویژه هنگام ارزیابی کیفیت و باروری اسپرم.
  • نمونه های ادرار: ادرار ممکن است حاوی DNA بدون سلول باشد و آزمایش متیلاسیون روی DNA ادراری در محیط های تحقیقاتی برای شرایطی مانند سرطان مثانه مورد بررسی قرار گرفته است.
  • بیوپسی جفت: در مطالعات مربوط به بارداری و رشد جنین، محققان ممکن است الگوهای متیلاسیون در بافت جفت را برای درک تنظیم اپی ژنتیک در دوران بارداری تجزیه و تحلیل کنند.
  • نمونه مایع مغزی نخاعی (CSF): در تحقیقات عصبی یا هنگام بررسی اختلالات مؤثر بر سیستم عصبی مرکزی، تجزیه و تحلیل متیلاسیون روی DNA استخراج شده از مایع مغزی نخاعی ممکن است در نظر گرفته شود.
  •  کشت سلولی: محققان اغلب از رده های سلولی تثبیت شده در مطالعات آزمایشگاهی برای بررسی الگوهای متیلاسیون خاص در شرایط آزمایشی کنترل شده استفاده می کنند.
  • سلول های باکال (Buccal Cells): سواب های داخل گونه (سلول های باکال) را می توان برای استخراج DNA و آزمایش متیلاسیون جمع آوری کرد. این یک روش غیر تهاجمی است که اغلب در مطالعات مربوط به نوزادان یا جمعیت هایی که جمع آوری خون ممکن است چالش برانگیز باشد، استفاده می شود.

نمونه های مورد نیاز برای آزمایش متیلاسیون

روش های مختلف جمع آوری نمونه های آزمایشگاه

روش های مختلف جمع آوری نمونه های آزمایشگاه

لوله های آزمایش و ضد انعقادها (Test tubes and Anticoagulants)

لوله های آزمایش و ضد انعقادها (Test tubes and Anticoagulants)

ذخیره سازی نمونه های آزمایشگاهی

ذخیره سازی نمونه های آزمایشگاهی

آمادگی قبل از انجام آزمایش متیلاسیون (methylation test):

به آمادگی خاصی مانند ناشتایی نیاز ندارد

روش های مختلف آزمایشگاهی انجام آزمایش متیلاسیون (methylation test):

روش واکنش زنجیره ای پلیمراز اختصاصی متیلاسیون (MSP یا MS-PCR):

MSP یا MS-PCR تکنیکی است که برای تشخیص متیلاسیون DNA در سایت های خاص CpG استفاده می شود. این روش به طور گسترده برای ارزیابی وضعیت متیلاسیون ژن های خاص یا مناطق ژنومی مورد استفاده قرار می گیرد. این اصل شامل درمان DNA با بی سولفیت برای تبدیل سیتوزین های متیله نشده به اوراسیل است در حالی که سیتوزین های متیله بدون تغییر باقی می ماند. متعاقباً، تقویت PCR با پرایمرهای طراحی شده برای هدف قرار دادن توالی DNA متیله یا غیر متیله انجام می شود. سپس محصولات PCR به دست آمده برای تعیین وضعیت متیلاسیون آنالیز می شوند.

  • استخراج DNA: با استخراج DNA ژنومی از نمونه بیولوژیکی مورد نظر مانند خون، بافت یا سلول شروع کنید. اطمینان حاصل کنید که DNA با کیفیت بالا به دست آمده است.
  • تصفیه بی سولفیت: DNA استخراج شده را با بی سولفیت سدیم درمان کنید. این تیمار شیمیایی سیتوزین های متیله نشده را به اوراسیل تبدیل می کند، در حالی که سیتوزین های متیله را بدون تغییر باقی می گذارد. این تبدیل برای تشخیص سیتوزین های متیله و غیر متیله در طی مراحل بعدی PCR بسیار مهم است.
  • طراحی پرایمر: طراحی پرایمرهایی که به طور خاص منطقه مورد نظر را با در نظر گرفتن سیتوزین های تبدیل شده هدف قرار می دهند. به طور معمول، دو مجموعه از پرایمرها طراحی می شوند: یک مجموعه مخصوص توالی متیله و مجموعه دیگری برای توالی متیله نشده. پرایمرها به گونه‌ای طراحی شده‌اند که مکان‌های CpG را بپوشانند تا وضعیت متیلاسیون آن مکان‌ها را ثبت کنند.
  • تقویت MSP:دو واکنش PCR جداگانه را با استفاده از DNA تیمار شده با بی سولفیت به عنوان الگو انجام دهید:
    – واکنش متیله: از پرایمرهای مخصوص توالی متیله استفاده کنید.
    واکنش متیله نشده: از پرایمرهای مخصوص توالی متیله نشده استفاده کنید.
  • شرایط چرخه PCR: از شرایط چرخه PCR استفاده کنید که شامل مراحل دناتوره کردن، بازپخت و گسترش است. دما و مدت هر مرحله به طراحی پرایمر و نیازهای خاص سیستم PCR مورد استفاده بستگی دارد.
  • ژل الکتروفورز: پس از تقویت PCR، محصولات به دست آمده را با استفاده از ژل الکتروفورز آنالیز کنید. محصولات را روی یک ژل آگارز جدا کنید و نوارها را زیر نور فرابنفش (UV) تجسم کنید.
  • تفسیر نتیجه: ژل را برای تعیین وجود یا عدم وجود نوارها در واکنش های متیله و غیر متیله بررسی کنید. الگوی باندها وضعیت متیلاسیون منطقه مورد نظر را منعکس می کند.
  • کنترل ها: در واکنش های PCR، کنترل های مثبت و منفی را لحاظ کنید. کنترل های مثبت موفقیت واکنش PCR را تضمین می کنند و کنترل های منفی به شناسایی آلودگی احتمالی کمک می کنند.
  •  MSP کمی (qMSP): برای ارزیابی کمی، می توان از PCR کمی در زمان واقعی (qPCR) استفاده کرد. رنگ های فلورسنت یا پروب های مخصوص توالی های متیله یا غیر متیله استفاده می شود که امکان اندازه گیری کمی سطوح متیلاسیون را فراهم می کند.
  • تجزیه و تحلیل داده ها: نتایج را به صورت کمی در صورت استفاده از qMSP یا به صورت کیفی بر اساس وجود یا عدم وجود نوارها روی ژل در MSP معمولی تجزیه و تحلیل کنید.

روش واکنش زنجیره ای پلیمراز اختصاصی متیلاسیون MSP یا MS PCR

MSP یک روش همه کاره و پرکاربرد برای مطالعه متیلاسیون DNA در مناطق ژنومی خاص است. این بینش های ارزشمندی را در مورد تنظیم اپی ژنتیکی ژن ها ارائه می دهد و به ویژه در تحقیقات و تشخیص سرطان، جایی که متیلاسیون نابجای DNA معمولاً مشاهده می شود، مفید است.

روش توالی یابی بی سولفیت (Bisulfite Sequencing):

توالی یابی بی سولفیت یک روش پرکاربرد برای تجزیه و تحلیل الگوهای متیلاسیون DNA در وضوح تک نوکلئوتیدی است. این تکنیک شامل درمان DNA ژنومی با بی سولفیت سدیم است که سیتوزین های متیله نشده را به اوراسیل تبدیل می کند و سیتوزین های متیله را بدون تغییر باقی می گذارد. توالی یابی بعدی DNA تیمار شده امکان شناسایی سیتوزین های متیله و غیر متیله را فراهم می کند. در اینجا شرح مفصلی از روش توالی بی سولفیت ارائه شده است:

  • استخراج DNA: با استخراج DNA ژنومی از نمونه بیولوژیکی مورد نظر شروع کنید. اطمینان حاصل کنید که روش استخراج DNA DNA با کیفیت بالا و دست نخورده به دست می دهد.
  • تصفیه بی سولفیت: DNA استخراج شده را با بی سولفیت سدیم درمان کنید. این تیمار شیمیایی سیتوزین های متیله نشده را از طریق دآمیناسیون به اوراسیل تبدیل می کند در حالی که سیتوزین های متیله را بدون تغییر باقی می گذارد. واکنش معمولاً در حضور یک عامل سولفونه‌کننده انجام می‌شود.
  • نمک زدایی/تصفیه: برای حذف نمک ها و سایر محصولات جانبی واکنش، DNA تیمار شده با بی سولفیت را خالص کنید. روش های مختلف تصفیه، مانند ستون های چرخشی یا مهره های مغناطیسی، می تواند مورد استفاده قرار گیرد.
  • دناتوره سازی و خنثی سازی: DNA تیمار شده با بی سولفیت را دناتوره کنید تا DNA تک رشته ای بدست آید. واکنش را خنثی کنید تا DNA برای مراحل بعدی آماده شود.
  • طراحی پرایمر: طراحی پرایمرهای مخصوص منطقه مورد نظر با در نظر گرفتن سیتوزین های تبدیل شده حاصل از تیمار بی سولفیت. پرایمرها باید طوری طراحی شوند که هم DNA متیله و هم غیر متیله را تقویت کنند.
  • تقویت PCR: انجام تقویت PCR با استفاده از DNA تیمار شده با بی سولفیت به عنوان الگو و پرایمرهای طراحی شده. این مرحله ناحیه خاص مورد نظر را تقویت می کند و امکان توالی یابی بعدی را فراهم می کند.
  • آماده سازی کتابخانه: تهیه کتابخانه های توالی یابی از محصولات تقویت شده با PCR. این ممکن است شامل مراحل اضافی مانند تعمیر انتهایی، بستن آداپتور و انتخاب اندازه باشد، بسته به پلت فرم توالی مورد استفاده.
  • توالی یابی: توالی DNA تیمار شده با بی سولفیت را با استفاده از یک پلت فرم توالی یابی با توان عملیاتی بالا، مانند Illumina یا سایر فناوری های توالی یابی نسل بعدی، تعیین توالی کنید. توالی خوانی اطلاعاتی در مورد سیتوزین های تبدیل شده فراهم می کند و امکان شناسایی سیتوزین های متیله و غیر متیله را در وضوح تک نوکلئوتیدی فراهم می کند.
  • تجزیه و تحلیل داده ها: داده های توالی یابی را با استفاده از ابزارهای تخصصی بیوانفورماتیک برای تعیین وضعیت متیلاسیون در هر موقعیت سیتوزین تجزیه و تحلیل کنید. این شامل مقایسه خواندن های توالی شده با ژنوم مرجع، با در نظر گرفتن تغییرات ناشی از بی سولفیت است.
  • تجسم: الگوهای متیلاسیون را در امتداد ناحیه توالی‌بندی شده، که اغلب به صورت نقشه حرارتی متیلاسیون CpG یا نمودار متیلاسیون سیتوزین نشان داده می‌شود، تجسم کنید.

روش توالی یابی بی سولفیت Bisulfite Sequencing

توالی‌یابی بی سولفیت اطلاعات دقیقی در مورد وضعیت متیلاسیون (methylation) سیتوزین‌ها ارائه می‌دهد و آن را به ابزاری قدرتمند برای مطالعه الگوهای متیلاسیون DNA در مناطق مختلف ژنومی تبدیل می‌کند. معمولاً در تحقیقات اپی ژنتیک، مطالعات سرطان و تحقیقات در مورد فرآیندهای رشدی استفاده می شود.

روش هضم آنزیم محدود کننده حساس به متیلاسیون:

این روش تکنیکی است که برای تجزیه و تحلیل الگوهای متیلاسیون DNA با هضم انتخابی DNA در مکان هایی که به متیلاسیون حساس هستند استفاده می شود. این روش متکی بر استفاده از آنزیم‌های محدودکننده است که توالی‌های DNA خاص را تشخیص می‌دهند و DNA را تنها زمانی می‌شکنند که سیتوزین در توالی شناسایی متیله نشده باشد. در اینجا شرح مفصلی از روش هضم آنزیم محدود کننده حساس به متیلاسیون آورده شده است:

  •  استخراج DNA: با استخراج DNA ژنومی از نمونه بیولوژیکی مورد نظر شروع کنید و مطمئن شوید که DNA از کیفیت بالایی برخوردار است.
  • انتخاب آنزیم محدود کننده: یک آنزیم محدود کننده حساس به متیلاسیون را انتخاب کنید که یک توالی DNA خاص را تشخیص دهد و DNA را تنها در صورتی جدا کند که سیتوزین درون توالی شناسایی متیله نشده باشد.
  • هضم آنزیمی: هضم آنزیم محدود را با انکوبه کردن DNA جدا شده با آنزیم محدود کننده حساس به متیلاسیون انتخابی انجام دهید. این مرحله DNA را در مکان هایی که سیتوزین در توالی شناسایی غیر متیله است می شکافد و مکان های متیله شده را دست نخورده باقی می گذارد.
  • ژل الکتروفورز: قطعات DNA هضم شده را با استفاده از الکتروفورز ژل جدا کنید. ژل باید امکان تفکیک قطعات DNA را بر اساس اندازه فراهم کند.
  • تجسم: برای تجسم قطعات DNA، ژل را رنگ آمیزی کنید. وجود یا عدم وجود قطعات خاص نشان دهنده وضعیت متیلاسیون سیتوزین ها در توالی تشخیص است.
  • نمونه های کنترل: نمونه های کنترل را در آزمایش بگنجانید. این ممکن است شامل DNA هضم نشده (کنترل مثبت) و DNA تیمار شده با آنزیم محدود کننده حساس به متیلاسیون (کنترل منفی) برای تایید ویژگی آنزیم حساس به متیلاسیون باشد.
  • تعیین کمی (اختیاری): به صورت اختیاری، شدت باندهای DNA را با استفاده از چگالی سنجی یا روش های دیگر تعیین کنید تا ارزیابی نیمه کمی از سطوح متیلاسیون ارائه شود.
  •  اعتبار سنجی: برای تایید وضعیت متیلاسیون ناحیه DNA مورد بررسی، نتایج را با استفاده از روش های جایگزین مانند تعیین توالی بی سولفیت یا PCR اختصاصی متیلاسیون (MSP) تأیید کنید.
  • تجزیه و تحلیل داده ها: نتایج الکتروفورز ژل را برای تعیین وضعیت متیلاسیون آنالیز کنید. وجود یا عدم وجود قطعات خاص DNA نشان می دهد که آیا سیتوزین ها در توالی شناسایی متیله شده اند یا غیر متیله.
  • تفسیر: نتایج را در زمینه ناحیه DNA خاص تحت بررسی تفسیر کنید. عدم وجود قطعات شکاف نشان دهنده متیلاسیون در محل تشخیص است، در حالی که وجود قطعات شکاف نشان دهنده عدم متیلاسیون است.

روش هضم آنزیم محدود کننده حساس به متیلاسیون

هضم آنزیم محدود کننده حساس به متیلاسیون یک روش مفید برای شناسایی متیلاسیون در مکان های خاص در ژنوم است. با این حال، اطلاعاتی در مورد تعداد محدودی از سایت های CpG در توالی تشخیص آنزیم انتخابی ارائه می دهد. محققان اغلب این روش را با تکنیک های دیگر برای درک جامع تر از الگوهای متیلاسیون DNA ترکیب می کنند.

روش ریزآرایه های متیلاسیون (Methylation microarrays):

ریزآرایه های متیلاسیون (methylation) ابزار قدرتمندی برای ارزیابی الگوهای متیلاسیون DNA در مقیاس وسیع ژنوم هستند. این ریزآرایه ها از پروب هایی استفاده می کنند که به طور خاص توالی های DNA متیله یا غیر متیله را تشخیص می دهند. این فناوری معمولاً در تحقیقات اپی ژنتیک و مطالعات بالینی برای بررسی الگوهای متیلاسیون جهانی در مناطق مختلف ژنومی مورد استفاده قرار می گیرد. در اینجا شرح مفصلی از روش ریزآرایه متیلاسیون آورده شده است:

  • آماده سازی نمونه: با استخراج DNA ژنومی از نمونه بیولوژیکی مورد نظر شروع کنید و از DNA با کیفیت بالا اطمینان حاصل کنید. نمونه ممکن است از بافت ها، سلول ها یا منابع دیگر باشد.
  • تصفیه بی سولفیت: DNA ژنومی را با بی سولفیت سدیم درمان کنید تا سیتوزین های متیله نشده به اوراسیل تبدیل شوند در حالی که سیتوزین های متیله شده بدون تغییر باقی می مانند. این مرحله برای تمایز بین DNA متیله و غیر متیله بسیار مهم است.
  • طراحی هیبریداسیون: طراحی یک ریزآرایه با پروب هایی که به طور خاص مناطق غنی از CpG را در سراسر ژنوم مورد هدف قرار می دهد. پروب ها را می توان برای تمایز بین توالی های DNA متیله و غیر متیله طراحی کرد.
  • بیوتینیلاسیون: قطعات DNA تبدیل شده به بی سولفیت را بیوتینیل کنید. این اغلب با ترکیب نوکلئوتیدهای نشاندار شده با بیوتین در طی یک مرحله تقویت PCR انجام می شود.
  • دناتوره سازی: قطعات DNA بیوتینیله شده را برای بدست آوردن DNA تک رشته ای دناتوره کنید.
  • هیبریداسیون آرایه: قطعات DNA بیوتینیله شده را به ریزآرایه متیلاسیون طراحی شده هیبرید کنید. این شامل انکوباسیون DNA دناتوره شده با ریزآرایه است که به DNA اجازه می دهد به پروب های مکمل روی آرایه متصل شود.
  • شستشو: ریزآرایه را بشویید تا DNA غیر متصل شده را حذف کنید و از ویژگی در هیبریداسیون اطمینان حاصل کنید.
  • رنگ آمیزی: ریزآرایه را با رنگ فلورسنت یا سایر روش های تشخیص رنگ آمیزی کنید. قطعات DNA بیوتینیله که با پروب ها هیبرید شده اند قابل تشخیص خواهند بود.
  • اسکن: از یک اسکنر ریزآرایه برای گرفتن تصاویر از ریزآرایه رنگ شده استفاده کنید. شدت سیگنال در هر موقعیت کاوشگر میزان DNA متصل شده و در نتیجه سطح متیلاسیون را منعکس می کند.
  • استخراج داده ها: داده های خام به دست آمده از اسکنر میکروآرایه را استخراج و پردازش کنید. این شامل تبدیل شدت فلورسنت به مقادیر متیلاسیون برای هر سایت CpG کاوش شده است.
  • تجزیه و تحلیل داده ها: تجزیه و تحلیل داده های متیلاسیون برای شناسایی مناطق متیله متفاوت (DMRs) یا سایت های خاص CpG با الگوهای متیلاسیون تغییر یافته. این ممکن است شامل تجزیه و تحلیل آماری و رویکردهای بیوانفورماتیک باشد.
  • تفسیر: داده های متیلاسیون را در زمینه سوال بیولوژیکی یا بیماری مورد مطالعه تفسیر کنید. مناطق یا ژن هایی را که تغییرات متیلاسیون قابل توجهی را نشان می دهند، شناسایی کنید.

روش ریزآرایه های متیلاسیون Methylation microarrays

ریزآرایه‌های متیلاسیون (methylation) یک رویکرد با توان بالا و گسترده ژنوم برای ارزیابی الگوهای متیلاسیون DNA ارائه می‌کنند. آنها به ویژه برای مطالعات در مقیاس بزرگ که اساس اپی ژنتیکی بیماری ها یا تأثیر عوامل محیطی بر متیلوم را بررسی می کنند مفید هستند.

روش توالی‌یابی نسل بعدی (NGS):

NGS یک روش قدرتمند و با کارایی بالا برای مطالعه متیلاسیون DNA در سطح ژنومی است. روشی که معمولاً برای تجزیه و تحلیل متیلاسیون استفاده می شود، توالی یابی بی سولفیت کل ژنوم (WGBS) است که شامل تیمار بی سولفیت برای تشخیص سیتوزین های متیله و غیر متیله می شود. در اینجا شرح مفصلی از روش NGS برای انجام آزمایش متیلاسیون آورده شده است:

  • آماده سازی نمونه: با استخراج DNA ژنومی از نمونه بیولوژیکی مورد نظر شروع کنید و از DNA با کیفیت بالا اطمینان حاصل کنید.
  • تصفیه بی سولفیت: DNA ژنومی را با بی سولفیت سدیم درمان کنید. این تیمار شیمیایی سیتوزین های متیله نشده را به اوراسیل تبدیل می کند در حالی که سیتوزین های متیله را بدون تغییر باقی می گذارد.
  • آماده سازی کتابخانه: یک کتابخانه توالی یابی از DNA تیمار شده با بی سولفیت تهیه کنید. این شامل مراحلی مانند ترمیم انتهایی، بستن آداپتور و تقویت PCR است. DNA تبدیل شده به بی سولفیت اغلب شکننده است، بنابراین در هنگام آماده سازی کتابخانه دقت خاصی صورت می گیرد.
  • توالی: کتابخانه DNA تبدیل شده به بی سولفیت را با استفاده از پلتفرم توالی یابی نسل بعدی، مانند ایلومینا، توالی یابی کنید. ماهیت بازده بالای NGS امکان توالی یابی همزمان میلیون ها قطعه DNA را فراهم می کند.
  • خواندن تراز (Read Alignment): توالی خوانده شده را با یک ژنوم مرجع تراز کنید. این مرحله شامل نگاشت قطعات توالی کوتاه به مکان های ژنومی مربوطه آنها است.
  • فراخوانی متیلاسیون: از ابزارهای بیوانفورماتیک برای فراخوانی وضعیت متیلاسیون در هر موقعیت سیتوزین در قرائت های تراز شده استفاده کنید. این شامل تمایز بین سیتوزین های تبدیل شده و تبدیل نشده است، که امکان شناسایی سایت های متیله و غیر متیله CpG را فراهم می کند.
  • تجزیه و تحلیل داده ها: تجزیه و تحلیل داده های متیلاسیون برای شناسایی مناطق متیله متفاوت (DMRs) یا سایت های خاص CpG با الگوهای متیلاسیون تغییر یافته. این ممکن است شامل تجزیه و تحلیل آماری و رویکردهای بیوانفورماتیک برای تفسیر مقدار زیادی از داده های توالی یابی باشد.
  • تجسم (Annotation and Visualization): داده های متیلاسیون را با ویژگی های ژنومی، مانند اجسام ژنی، پروموترها و تقویت کننده ها حاشیه نویسی کنید. ابزارهای تجسم را می توان برای ایجاد نقشه های متیلاسیون و کشف توزیع متیلاسیون در ژنوم استفاده کرد.
  • اعتبار سنجی: برای تایید صحت یافته های NGS، نتایج را با استفاده از روش های جایگزین مانند تعیین توالی بی سولفیت هدفمند یا PCR اختصاصی متیلاسیون تایید کنید.
  • تفسیر: داده های متیلاسیون را در زمینه سوال بیولوژیکی یا بیماری مورد مطالعه تفسیر کنید. مناطق یا ژن هایی را که تغییرات متیلاسیون قابل توجهی را نشان می دهند، شناسایی کنید.
  • ادغام با سایر داده ها: داده های متیلاسیون را با سایر داده های omics، مانند بیان ژن یا دسترسی کروماتین، ادغام کنید تا درک جامعی از پیامدهای عملکردی تغییرات متیلاسیون به دست آورید.

روش توالی یابی نسل بعدی NGS برای بررسی متیلاسیون

تجزیه و تحلیل متیلاسیون مبتنی بر NGS یک نمای دقیق و گسترده ژنومی از الگوهای متیلاسیون DNA ارائه می دهد. این یک روش همه کاره است که در زمینه‌های مختلف، از جمله تحقیقات سرطان، اپی ژنتیک، و زیست‌شناسی تکاملی برای کشف پیچیدگی متیلوم استفاده می‌شود.

NGS | توالی یابی نسل بعدی | Next-generation sequencing | توالی یابی با توان بالا | High-throughput sequencing

NGS | توالی یابی نسل بعدی | Next-generation sequencing | توالی یابی با توان بالا | High-throughput sequencing

روش ذوب با وضوح بالا مخصوص متیلاسیون (MS-HRM):

MS-HRM یک روش حساس و مقرون به صرفه برای تجزیه و تحلیل الگوهای متیلاسیون DNA است. این ترکیبی از تیمار بی سولفیت است که سیتوزین‌های متیله نشده را به اوراسیل تبدیل می‌کند و آنالیز ذوب با وضوح بالا را برای تمایز بین توالی‌های DNA متیله و غیر متیله ترکیب می‌کند. در اینجا شرح مفصلی از روش MS-HRM برای انجام آزمایش متیلاسیون آورده شده است:

  • استخراج DNA: با استخراج DNA ژنومی از نمونه بیولوژیکی مورد نظر شروع کنید و از DNA با کیفیت بالا اطمینان حاصل کنید.
  • تصفیه بی سولفیت: DNA ژنومی را با بی سولفیت سدیم درمان کنید. این تیمار شیمیایی سیتوزین های متیله نشده را به اوراسیل تبدیل می کند در حالی که سیتوزین های متیله را بدون تغییر باقی می گذارد.
  • طراحی پرایمر: طراحی پرایمرهای مخصوص منطقه مورد نظر با در نظر گرفتن سیتوزین های تبدیل شده حاصل از تیمار بی سولفیت. پرایمرها معمولاً به گونه‌ای طراحی می‌شوند که چندین سایت CpG را پوشش دهند تا وضعیت متیلاسیون آن مکان‌ها را ثبت کنند.
  • تقویت PCR: انجام تقویت PCR با استفاده از DNA تیمار شده با بی سولفیت به عنوان الگو و پرایمرهای طراحی شده. این مرحله منطقه خاص مورد نظر را تقویت می کند و امکان تجزیه و تحلیل ذوب با وضوح بالا را فراهم می کند.
  • تحلیل ذوب با وضوح بالا (HRM): محصولات تقویت شده با PCR را تحت آنالیز ذوب با وضوح بالا قرار دهید. این شامل افزایش تدریجی دما برای دناتوره کردن DNA دو رشته‌ای و نظارت بر تغییرات فلورسانس هنگام جدا شدن رشته‌های DNA است.
  • تولید منحنی فلورسانس: منحنی فلورسانس ایجاد شده در طول تجزیه و تحلیل ذوب را ثبت کنید. شکل و دمای منحنی ذوب تحت تأثیر محتوای GC، طول و ترکیب توالی محصول PCR است.
  • نرمال سازی: منحنی فلورسانس را برای تصحیح تغییرات در غلظت DNA و کارایی PCR عادی کنید. این مرحله برای مقایسه دقیق بین نمونه ها ضروری است.
  • تمایز متیلاسیون: منحنی ذوب نرمال شده را برای تمایز بین DNA متیله و غیر متیله تجزیه و تحلیل کنید. نمونه های متیله و غیر متیله اغلب پروفایل های منحنی ذوب مشخصی را نشان می دهند.
  • تجزیه و تحلیل داده ها: تجزیه و تحلیل داده ها با استفاده از نرم افزار اختصاصی برای تعیین کمیت سطح متیلاسیون در سایت های خاص CpG. این ممکن است شامل مقایسه شکل‌های منحنی ذوب و دما بین نمونه‌ها باشد.
  • کنترل ها: کنترل های مثبت و منفی را در آزمایش بگنجانید. کنترل های مثبت باید حاوی نسبت های شناخته شده DNA متیله و غیر متیله باشند، در حالی که کنترل های منفی به شناسایی آلودگی بالقوه کمک می کنند.
  • تفسیر: نتایج را در زمینه وضعیت متیلاسیون منطقه مورد نظر تفسیر کنید. سطح متیلاسیون را کمی کنید و تفاوت بین نمونه ها را ارزیابی کنید.

روش ذوب با وضوح بالا مخصوص متیلاسیون MS HRM

MS-HRM به ویژه برای تجزیه و تحلیل متیلاسیون (methylation) هدفمند مکان یا ژن های خاص مفید است و در تحقیقات و کاربردهای تشخیصی مختلف، از جمله مطالعات سرطان و تحقیقات اپی ژنتیکی به کار می رود. این یک رویکرد نسبتاً سریع و مقرون به صرفه برای ارزیابی الگوهای متیلاسیون DNA ارائه می دهد.

چه چیزی در آزمایش متیلاسیون (methylation test) مورد بررسی قرار می گیرد؟

ژنتیک مطالعه تغییرات ارثی در فعالیت یا عملکرد ژن به دلیل تغییر مستقیم توالی DNA است. چنین تغییراتی شامل جهش نقطه ای، حذف، درج و جابجایی است. در مقابل، اپی ژنتیک مطالعه تغییرات ارثی در فعالیت یا عملکرد ژن است که با هیچ تغییری در خود توالی DNA مرتبط نیست.

اگرچه تقریباً تمام سلول‌های موجود در یک ارگانیسم حاوی اطلاعات ژنتیکی یکسانی هستند، اما همه ژن‌ها به طور همزمان توسط همه انواع سلول بیان نمی‌شوند. در مفهوم وسیع‌تر، مکانیسم‌های اپی ژنتیک، پروفایل‌های بیان ژنی متنوع را در انواع سلول‌ها و بافت‌های موجودات چند سلولی واسطه می‌کنند.

متیلاسیون (methylation) ، یک اصلاح اپی ژنتیکی است که، نقشی اساسی در تنظیم بیان ژن، تمایز سلولی و ثبات ژنوم ایفا می کند. این فرآیند پویا شامل افزودن یک گروه متیل به موقعیت کربن 5 باقیمانده‌های سیتوزین در DNA، تشکیل 5 متیل سیتوزین است. این اصلاح اپی ژنتیکی به عنوان یک لایه حیاتی از کنترل ژنومی عمل می کند و بر فرآیندهای بیولوژیکی مختلف در طول توسعه، پیری و بیماری تأثیر می گذارد.

مکانیسم متیلاسیون DNA:

متیلاسیون (methylation) توسط آنزیم های DNA متیل ترانسفراز (DNMTs) کاتالیز می شود. DNMT1 در درجه اول مسئول حفظ الگوهای متیلاسیون در طول تقسیم سلولی است، در حالی که DNMT3a و DNMT3b در متیلاسیون de novo دخیل هستند. این فرآیند شامل انتقال یک گروه متیل از S-adenosylmethionine (SAM) به حلقه سیتوزین است و 5-methylcytosine را تشکیل می دهد. متیلاسیون عمدتاً در دی نوکلئوتیدهای CpG رخ می دهد، جایی که سیتوزین ها توسط گوانین ها دنبال می شوند. مکانیسم متیلاسیون DNA را می توان به چند مرحله کلیدی تقسیم کرد:

  • تشخیص و اتصال: فرآیند متیلاسیون DNA با شناسایی توالی های خاص DNA توسط DNMT ها آغاز می شود. این آنزیم ها مسئول افزودن گروه های متیل به سیتوزین ها در زمینه دی نوکلئوتیدهای CpG هستند (جایی که پس از سیتوزین گوانین آمده است).
  • استفاده از بستر مشترک: سوبسترای متیلاسیون DNA S-adenosylmethionine (SAM) است که گروه متیل را فراهم می کند که به سیتوزین منتقل می شود. SAM به عنوان دهنده متیل در این واکنش آنزیمی عمل می کند.
  • واکنش متیلاسیون (methylation): آنزیم DNMT انتقال گروه متیل را از SAM به موقعیت کربن 5 سیتوزین درون دی نوکلئوتید CpG کاتالیز می کند. این منجر به تشکیل 5 متیل سیتوزین می شود.
  • متیلاسیون (methylation) نگهداری: در طول تقسیم سلولی، حفظ الگوهای متیلاسیون DNA در سلول های دختر بسیار مهم است. DNMT1، متیل ترانسفراز نگهدارنده، DNA همی متیله را تشخیص می دهد (که در آن یک رشته متیله است و رشته دیگر متیله نیست) و رشته غیر متیله را متیله می کند و از انتقال وفادار اطلاعات اپی ژنتیک اطمینان می دهد.
  • متیلاسیون De Novo: آنزیم های DNMT3a و DNMT3b مسئول متیلاسیون de novo هستند، به این معنی که می توانند گروه های متیل را به سایت های CpG که قبلا متیله نشده بودند اضافه کنند. این فرآیند به ویژه در طول رشد اولیه و تمایز سلولی مهم است.
  • الگوهای متیلاسیون (methylation) : الگوهای متیلاسیون DNA پویا هستند و می توانند در مناطق مختلف ژنومی متفاوت باشند. جزایر CpG، که مناطق غنی از CG هستند که اغلب در نزدیکی پروموترهای ژن یافت می شوند، مکان های بسیار مهمی برای تنظیم اپی ژنتیک هستند. هیپرمتیلاسیون جزایر CpG در پروموترهای ژن به طور کلی با سرکوب رونویسی همراه است.
  • خاموشی اپی ژنتیک: متیلاسیون DNA اغلب با خاموشی ژن همراه است. هنگامی که جزایر CpG در نواحی پروموتر ژن‌ها هیپرمتیله می‌شوند، مانع از اتصال فاکتورهای رونویسی و سایر پروتئین‌های تنظیم‌کننده می‌شود که منجر به سرکوب بیان ژن می‌شود.
  • د متیلاسیون DNA: علاوه بر متیلاسیون (methylation)، فرآیندهای فعال دی متیلاسیون DNA نیز وجود دارد. آنزیم‌های انتقال Ten-eleven translocation (TET) می‌توانند 5-متیل سیتوزین را اکسید کنند تا شکل‌های میانی تولید کنند که می‌توانند بیشتر اصلاح شوند و در نهایت با سیتوزین غیر متیله جایگزین شوند.

 

مکانیسم های متیلاسیون DNA

مسیرهای متیلاسیون DNA خانواده ای از DNA متیل ترانسفرازها (Dnmts) انتقال یک گروه متیل از S-adenyl methionine (SAM) به کربن پنجم باقیمانده سیتوزین را کاتالیز می کنند تا 5-methylcytosine (5mC) را تشکیل دهند. (a) Dnmt3a و Dnmt3b Dnmts گروه های متیل (قرمز) را به DNA برهنه منتقل می کنند. (b) Dnmt1 نگهدارنده است و الگوی متیلاسیون DNA را در طول همانندسازی حفظ می کند. هنگامی که DNA تحت تکثیر نیمه محافظه کارانه قرار می گیرد، پایه DNA والدین الگوی متیلاسیون DNA اصلی (خاکستری) را حفظ می کند. Dnmt1 در کانون‌های همانندسازی مرتبط می‌شود و الگوی متیلاسیون DNA اصلی را با افزودن گروه‌های متیل (قرمز) به رشته دختر تازه تشکیل‌شده (آبی) دقیقاً تکرار می‌کند.

درک مکانیسم های متیلاسیون DNA برای کشف پیچیدگی های تنظیم اپی ژنتیک و تأثیر آن بر عملکرد سلولی و بیماری بسیار مهم است. بی نظمی متیلاسیون DNA پیامدهای عمیقی برای سلامت انسان دارد و تحقیقات در حال انجام با هدف روشن کردن جزئیات پیچیده این فرآیند اپی ژنتیکی است.

اهمیت عملکردی متیلاسیون DNA:

در اینجا جنبه های کلیدی اهمیت عملکردی متیلاسیون DNA آورده شده است:

  • متیلاسیون (methylation) پروموتر و سرکوب رونویسی: متیلاسیون DNA در پروموترهای ژن معمولاً با سرکوب رونویسی همراه است. هیپرمتیلاسیون جزایر CpG در پروموترهای ژن مانع اتصال فاکتورهای رونویسی، RNA پلیمراز و سایر پروتئین های تنظیمی می شود که منجر به سرکوب بیان ژن می شود. این فرآیند برای خاموش کردن ژن‌های خاص در طول تمایز و توسعه سلولی بسیار مهم است.
  • متیلاسیون (methylation) بدنه ژن و پیرایش جایگزین (Gene Body Methylation and Alternative Splicing): برخلاف متیلاسیون پروموتر، متیلاسیون درون بدنه ژن نقش پیچیده تری دارد. متیلاسیون بدنه ژن با پیوند جایگزین همراه است و می تواند بر پردازش RNA تأثیر بگذارد. تصور می شود که این شکل متیلاسیون به تنظیم بیان ایزوفرم کمک می کند.
  • سرکوب ترانسپوزون ها و عناصر تکراری: متیلاسیون DNA با سرکوب ترانسپوزون ها و عناصر تکراری نقش حیاتی در حفظ ثبات ژنومی ایفا می کند. هیپومتیلاسیون این عناصر می تواند منجر به بی ثباتی ژنومی و انحرافات کروموزومی شود.
  • نگهداری ساختار کروموزوم: متیلاسیون DNA نیز به حفظ ساختار کروموزوم کمک می کند. به عنوان مثال، الگوهای متیلاسیون DNA مناسب برای پایداری مناطق هتروکروماتین و سانترومرها بسیار مهم است.
  • ایجاد و حفظ هویت سلولی: متیلاسیون DNA در تمایز سلولی و ایجاد و حفظ هویت سلولی نقش دارد. در طول توسعه، سلول ها تحت تغییرات دینامیکی در الگوهای متیلاسیون DNA قرار می گیرند که به تعیین رده های سلولی مختلف کمک می کند.
  • نقاط گذاری و تنظیم دوز والدین: متیلاسیون DNA برای نقش نگاری ژنومی بسیار مهم است، پدیده ای که در آن ژن های خاصی به روشی خاص از منشاء بیان می شوند. ژن های چاپ شده در رشد جنینی نقش دارند و در تنظیم دوز نقش دارند.
  • خاموش شدن یک کروموزوم X در زنان: متیلاسیون DNA در غیرفعال شدن کروموزوم X در زنان نقش دارد. یکی از کروموزوم های X در هر سلول غیرفعال می شود تا دوز جبران شود بین نر و ماده.
  •  توسعه سرطان: الگوهای متیلاسیون نابجای DNA یکی از مشخصه های سرطان است. هیپرمتیلاسیون پروموترهای ژن سرکوبگر تومور و هیپومتیلاسیون جهانی با تغییر بیان ژن و ترویج بی ثباتی ژنومی به انکوژنز کمک می کند.
  • اختلالات عصبی: متیلاسیون DNA در اختلالات عصبی از جمله اختلالات رشد عصبی و بیماری های عصبی دژنراتیو نقش دارد. الگوهای متیلاسیون تغییر یافته می تواند بر بیان ژن های دخیل در رشد و عملکرد عصبی تأثیر بگذارد.
  • پاسخ به محرک های محیطی: متیلاسیون DNA می تواند به عنوان یک حافظه اپی ژنتیک عمل کند و مواجهه ها و تجربیات محیطی را ثبت کند. تغییرات در الگوهای متیلاسیون در پاسخ به محرک های محیطی به سازگاری موجودات کمک می کند.

اهمیت عملکردی متیلاسیون DNA

درک اهمیت عملکردی متیلاسیون DNA، بینش هایی را در مورد مکانیسم های تنظیمی پیچیده حاکم بر فرآیندهای سلولی ارائه می دهد. بی نظمی متیلاسیون DNA با بیماری های مختلفی مرتبط است و آن را به مرکز تحقیقات برای مداخلات درمانی و استراتژی های تشخیصی تبدیل می کند. ماهیت دینامیکی متیلاسیون DNA نقش آن را در تنظیم پاسخ های سلولی و حفظ یکپارچگی ژنومی در طول عمر یک موجود زنده برجسته می کند.

پیامدهای بالینی متیلاسیون (methylation):

در اینجا برخی از پیامدهای بالینی کلیدی متیلاسیون DNA آورده شده است:

  • نشانگرهای زیستی برای تشخیص زودهنگام سرطان: الگوهای متیلاسیون نابجای DNA معمولا در سرطان های مختلف مشاهده می شود. تشخیص تغییرات متیلاسیون خاص، مانند هیپرمتیلاسیون پروموتر ژن های سرکوبگر تومور، به عنوان یک نشانگر زیستی ارزشمند برای تشخیص زودهنگام سرطان عمل می کند.
  • شاخص های پیش آگهی سرطان: الگوهای متیلاسیون DNA می تواند اطلاعات پیش آگهی را در بیماران سرطانی ارائه دهد. برخی از نشانه های متیلاسیون با پیشرفت بیماری، متاستاز و پیامدهای بیمار مرتبط هستند و به ایجاد استراتژی های درمانی کمک می کنند.
  • نشانگرهای پیش بینی کننده برای پاسخ به درمان در سرطان ها: وضعیت متیلاسیون می تواند به عنوان یک نشانگر پیش بینی کننده برای پاسخ به برخی درمان های سرطان عمل کند. این به شناسایی بیمارانی که احتمالاً به درمان های خاص پاسخ مثبت می دهند کمک می کند.
  •  نشانگرهای تشخیصی اختلالات عصبی: تغییرات متیلاسیون DNA در ژن های مرتبط با عملکرد عصبی در اختلالات رشد عصبی (به عنوان مثال، سندرم رت) و بیماری های عصبی (مانند بیماری آلزایمر) دخیل است. الگوهای متیلاسیون را می توان به عنوان نشانگرهای تشخیصی استفاده کرد.
  • اهداف درمانی بالقوه اختلالات عصبی: درک چشم انداز متیلاسیون در اختلالات عصبی بینش هایی را در مورد اهداف درمانی بالقوه برای مداخلات با هدف اصلاح پیشرفت بیماری ارائه می دهد.
  • عوامل خطر اپی ژنتیک در بیماری های قلبی عروقی: الگوهای متیلاسیون DNA با بیماری های قلبی عروقی مرتبط است. شناسایی تغییرات متیلاسیون خاص در ژن های مرتبط با متابولیسم لیپید، التهاب و عملکرد عروقی می تواند به عنوان عوامل خطر اپی ژنتیکی عمل کند.
  • نشانگرهای پیش بینی کننده عوارض در بیماری های قلبی عروقی: الگوهای متیلاسیون DNA خاص ممکن است خطر عوارض قلبی عروقی را پیش بینی کند و به طبقه بندی بیماران بر اساس حساسیت آنها به پیامدهای نامطلوب کمک کند.
  • بیومارکرهای سن بیولوژیکی: ساعت اپی ژنتیک، بر اساس الگوهای متیلاسیون DNA، به عنوان نشانگر زیستی سن بیولوژیکی عمل می کند. این بینشی در مورد روند پیری و بیماری های مرتبط با افزایش سن ارائه می دهد.
  • پیوند به بیماری های مرتبط با سن: انحراف در متیلاسیون DNA با بیماری های مرتبط با افزایش سن، از جمله سرطان، بیماری های قلبی عروقی و اختلالات عصبی مرتبط است. درک این ارتباطات می تواند مداخلات پیشگیرانه و درمانی را راهنمایی کند.
  • شناسایی زیرگروه های بیماری های خود ایمنی: الگوهای متیلاسیون DNA می تواند به شناسایی زیرگروه های مختلف بیماری های خودایمنی کمک کند. این طبقه بندی مولکولی به ایجاد استراتژی های درمانی بر اساس تغییرات اپی ژنتیکی کمک می کند.
  • اهداف درمانی بالقوه بیماری های خود ایمنی: اصلاحات اپی ژنتیکی، از جمله متیلاسیون DNA، به عنوان اهداف درمانی بالقوه در بیماری های خود ایمنی برای تعدیل پاسخ های ایمنی و کنترل پیشرفت بیماری مورد بررسی قرار می گیرند.
  • رویکردهای درمانی فردی: الگوهای متیلاسیون DNA ممکن است بر پاسخ های فردی به داروها تأثیر بگذارد. مطالعات فارماکوژنومیک، تغییرات اپی ژنتیکی را برای توسعه رویکردهای درمانی شخصی، تضمین اثربخشی بهینه دارو و به حداقل رساندن عوارض جانبی در نظر می‌گیرد.
  • ثبت مواجهه های محیطی و حافظه اپی ژنتیک: متیلاسیون DNA می تواند قرار گرفتن در معرض محیطی را ثبت کند و بینش هایی را در مورد تأثیر عوامل خارجی بر سلامت ارائه دهد. این حافظه اپی ژنتیک به درک اثرات طولانی مدت محرک های محیطی کمک می کند.
  • اپی ژنتیک محیطی: مطالعه متیلاسیون DNA در پاسخ به عوامل محیطی به زمینه اپی ژنتیک محیطی کمک می کند و قرار گرفتن در معرض محیطی را با پیامدهای سلامتی مرتبط می کند.

پیامدهای بالینی متیلاسیون DNA

 

اگرچه مغز دارای بالاترین سطوح متیلاسیون DNA نسبت به هر بافتی در بدن است، 5 mC تنها حدود 1 درصد از اسیدهای نوکلئیک در ژنوم انسان را تشکیل می دهد. اکثر متیلاسیون DNA روی سیتوزین هایی که قبل از نوکلئوتید گوانین یا سایت های CpG قرار دارند، رخ می دهد.

تنظیم دقیق زمانی متیلاسیون و دی متیلاسیون de novo به ویژه برای تمایز و بلوغ سیستم عصبی مرکزی پستانداران (CNS) مهم است. سلول های پیش ساز عصبی چند توان (NPCs) به طور متوالی تحت نوروژنز و گلیوژنز قرار می گیرند. به طور خاص، تغییر تمایز NPCها از نوروژنز به آستروگلیوژنز با رویدادهای متیلاسیون و دی متیلاسیون DNA در ناحیه پروموتور ژن پروتئین فیبریلاری اسیدی گلیال (Gfap) همزمان است.

سوالات متداول

متیلاسیون DNA چگونه به تنظیم ژن کمک می کند؟

متیلاسیون DNA با تأثیرگذاری بر دسترسی DNA به ماشین های رونویسی، نقش مهمی در تنظیم ژن ایفا می کند. در اینجا نحوه کمک آن آمده است:

  • متیلاسیون و سرکوب رونویسی: متیلاسیون در پروموترهای ژن، به ویژه در جزایر CpG، اغلب منجر به سرکوب رونویسی می شود. گروه های متیل مانع اتصال فاکتورهای رونویسی و RNA پلیمراز می شوند و از شروع رونویسی جلوگیری می کنند.
  • متیلاسیون بدنه ژن و Alternative Splicing: متیلاسیون در اجسام ژنی، به ویژه در نواحی بیرونی، می تواند الگوهای پیوند جایگزین را تحت تأثیر قرار دهد. این فرآیند می تواند منجر به تولید ایزوفرم های مختلف mRNA شود که بر تنوع پروتئین و عملکرد سلولی تأثیر می گذارد.
  • حافظه اپی ژنتیک و سازگاری با محیط: متیلاسیون DNA می تواند به عنوان یک حافظه اپی ژنتیکی، ثبت قرارگیری ها و تجربیات محیطی عمل کند. تغییرات در الگوهای متیلاسیون می‌تواند تطبیقی باشد و به سلول‌ها اجازه می‌دهد به نشانه‌های محیطی پاسخ دهند و بر این اساس بیان ژن را تعدیل کنند.
  • تمایز و توسعه سلولی: در طول توسعه، الگوهای متیلاسیون DNA دستخوش تغییرات دینامیکی شده و به تمایز سلولی کمک می کند. متیلاسیون به ایجاد و حفظ هویت سلولی با تنظیم بیان ژن‌های خاص دودمان کمک می‌کند.
  • پایداری ژنومی: متیلاسیون DNA برای حفظ ثبات ژنومی بسیار مهم است. این به سرکوب ترانسپوزون ها و عناصر تکراری کمک می کند و از فعال شدن نابجای آنها جلوگیری می کند که می تواند منجر به بی ثباتی ژنومی شود.

تفاوت بین متیلاسیون de novo و متیلاسیون نگهدارنده چیست؟

 متیلاسیون De Novo:

  • کاتالیز شده توسط DNMT3a و DNMT3b: متیلاسیون جدید شامل افزودن گروه های متیل به سایت های CpG که قبلا متیله نشده بودند می باشد. DNMT3a و DNMT3b آنزیم هایی هستند که مسئول متیلاسیون de novo هستند.
  • در طول رشد رخ می دهد: این فرآیند به ویژه در طول تکامل اولیه و تمایز سلولی مهم است، زمانی که سلول ها الگوهای متیلاسیون خاص مرتبط با اصل و نسب خود را بدست می آورند.

متیلاسیون De Novo

متیلاسیون نگهدارنده:

  • کاتالیز شده توسط DNMT1: متیلاسیون نگهدارنده شامل افزودن گروه های متیل به رشته جدید سنتز شده در طول همانندسازی DNA است. DNMT1 مسئول تشخیص DNA همی متیله (که در آن یک رشته متیله است و رشته دیگر متیله نیست) و متیله کردن رشته غیر متیله است.
  • تامین وراثت اپی ژنتیکی: متیلاسیون نگهدارنده، انتقال الگوهای متیلاسیون DNA به سلول های دختر را در طول تقسیم سلولی تضمین می کند.

متیلاسیون نگهدارنده

جزایر CpG چگونه با متیلاسیون DNA مرتبط هستند؟

جزایر CpG مناطقی از DNA هستند که با فرکانس بالای دی نوکلئوتیدهای CpG مشخص می شوند. رابطه بین جزایر CpG و متیلاسیون (methylation) به شرح زیر است:

  • مکان در پروموترهای ژن: جزایر CpG اغلب در نزدیکی پروموترهای ژن ها یافت می شوند. تقریباً 60-70 درصد پروموترهای ژن انسانی حاوی جزایر CpG هستند.
  • نقش در تنظیم ژن: جزایر CpG غیر متیله در پروموترهای ژن به طور کلی با رونویسی ژن فعال مرتبط هستند و امکان اتصال فاکتورهای رونویسی و شروع سنتز RNA را فراهم می کنند.
  • هایپر متیلاسیون و سرکوب رونویسی: هیپرمتیلاسیون جزایر CpG در پروموترهای ژن با سرکوب رونویسی همراه است. جزایر متیله CpG از اتصال فاکتورهای رونویسی جلوگیری می کنند که منجر به خاموش شدن بیان ژن می شود.
  • الگوهای متیلاسیون متفاوت: جزایر CpG می توانند الگوهای متیلاسیون متفاوتی را بین حالت های نرمال و بیمار نشان دهند. متیلاسیون نابجای جزایر CpG یک ویژگی مشترک در بیماری های مختلف از جمله سرطان است.

جزایر CpG

اهمیت متیلاسیون (methylation) در غیرفعال شدن کروموزوم X چیست؟

غیرفعال سازی کروموزوم X فرآیندی است که جبران دوز را بین مردان (XY) و زنان (XX) تضمین می کند. متیلاسیون DNA نقش مهمی در این فرآیند دارد:

  • خاموش شدن کروموزوم One X: در زنان، یکی از دو کروموزوم X به طور تصادفی انتخاب می شود تا در هر سلول غیرفعال شود. این تضمین می کند که بیان ژن های مرتبط با X بین نرها و ماده ها متعادل است.
  • مرکز غیرفعال سازی X (XIC): مرکز X-غیر فعال سازی (XIC) حاوی ژن XIST است که یک RNA طولانی غیر کد کننده (XIST RNA) تولید می کند. متیلاسیون DNA در XIC برای شروع و حفظ غیرفعال شدن کروموزوم X ضروری است.
  • پوشش RNA XIST: RNA XIST کروموزوم X غیرفعال را می پوشاند که منجر به فشرده شدن و خاموش شدن رونویسی آن می شود. متیلاسیون DNA در سایت های خاص CpG در ژن XIST در تنظیم بیان RNA XIST نقش دارد.
  • حافظه اپی ژنتیک: متیلاسیون DNA در XIC حفظ پایدار غیرفعال شدن کروموزوم X را در سراسر تقسیمات سلولی تضمین می کند و یک حافظه اپی ژنتیک ایجاد می کند که حالت غیرفعال را حفظ می کند.

متیلاسیون DNA چگونه در فرآیند پیری نقش دارد؟

متیلاسیون DNA با فرآیند پیری مرتبط است و تغییرات در الگوهای متیلاسیون (methylation) به فنوتیپ های مرتبط با سن کمک می کند. در اینجا نحوه متیلاسیون DNA در پیری نقش دارد:

  • ساعت های اپی ژنتیک: ساعت های اپی ژنتیک، بر اساس الگوهای متیلاسیون DNA خاص، به عنوان نشانگرهای زیستی سن بیولوژیکی عمل می کنند. این ساعت ها تخمینی از سن افراد را بر اساس وضعیت متیلاسیون (methylation) سایت های خاص CpG ارائه می دهند.
  • هیپو متیلاسیون و ناپایداری ژنومی: پیری اغلب با هیپومتیلاسیون، به ویژه در عناصر DNA تکراری همراه است. این هیپومتیلاسیون می تواند به بی ثباتی ژنومی و فعال شدن مجدد ترانسپوزون ها کمک کند.
  • پرومیتیلاسیون پروموتر و تغییرات رونویسی: برخی از پروموترها با افزایش سن هیپرمتیله می شوند که منجر به سرکوب ژن های مرتبط می شود. این می تواند بر عملکرد سلولی تأثیر بگذارد و به آسیب شناسی های مرتبط با سن کمک کند.
  • تاثیر بر پیری سلولی: تغییرات متیلاسیون DNA با پیری سلولی، حالت توقف برگشت ناپذیر چرخه سلولی مرتبط با پیری مرتبط است. تغییرات در الگوهای متیلاسیون به تنظیم ژن های دخیل در پیری کمک می کند.
  • تأثیر محیطی بر متیلاسیون (methylation) : عوامل محیطی و انتخاب های سبک زندگی می توانند بر الگوهای متیلاسیون DNA تأثیر بگذارند و به روند پیری کمک کنند. عواملی مانند رژیم غذایی، ورزش و قرار گرفتن در معرض سموم می توانند بر اپی ژنوم تأثیر بگذارند.

متیلاسیون DNA و فرآیند پیری

عوامل محیطی چگونه با تغییرات الگوهای متیلاسیون (methylation) مرتبط هستند؟

عوامل محیطی می توانند بر الگوهای متیلاسیون (methylation) تأثیر بگذارند و منجر به تغییرات در بیان ژن شوند. در اینجا چگونگی ارتباط عوامل محیطی با متیلاسیون DNA آمده است:

  • تغذیه و رژیم غذایی: عوامل غذایی، مانند فولات و سایر اهداکنندگان متیل، می توانند بر متیلاسیون DNA تأثیر بگذارند. دریافت ناکافی یا بیش از حد این مواد مغذی ممکن است الگوهای متیلاسیون را تغییر دهد.
  • قرار گرفتن در معرض سموم: قرار گرفتن در معرض سموم محیطی، آلاینده ها و مواد شیمیایی می تواند منجر به تغییر در متیلاسیون DNA شود. برخی از سموم ممکن است به عنوان اصلاح کننده اپی ژنتیک عمل کنند و بر الگوهای بیان ژن تأثیر بگذارند.
  • انتخاب سبک زندگی: عوامل سبک زندگی، از جمله استرس، فعالیت بدنی و الگوهای خواب، می توانند بر متیلاسیون DNA تأثیر بگذارند. به عنوان مثال، استرس مزمن با تغییرات در الگوهای متیلاسیون همراه بوده است.
  • داروها: برخی از داروها، به ویژه آنهایی که بر متابولیسم تک کربن تأثیر می گذارند، می توانند متیلاسیون DNA را تحت تأثیر قرار دهند. این در زمینه فارماکوژنومیک مرتبط است.
  • حافظه اپی ژنتیک: قرار گرفتن در معرض محیطی می تواند منجر به تغییرات پایدار در الگوهای متیلاسیون DNA شود و یک حافظه اپی ژنتیک ایجاد کند. این حافظه می تواند بر نتایج سلامتی بعدی در زندگی تأثیر بگذارد.
  • مواجهه های رشدی: قرار گرفتن در معرض در طول دوره های حیاتی رشد، مانند دوران بارداری و اوایل کودکی، می تواند اثرات طولانی مدتی بر الگوهای متیلاسیون DNA داشته باشد و حساسیت به بیماری های خاص را افزایش دهد.

آیا می توان الگوهای متیلاسیون DNA را در بین نسل ها به ارث برد؟

بله، الگوهای متیلاسیون (methylation) DNA را می توان در طول نسل ها به ارث برد، پدیده ای که به عنوان وراثت اپی ژنتیکی فرا نسلی شناخته می شود. در اینجا جنبه های کلیدی وجود دارد:

  • انتقال ژرملاین: الگوهای متیلاسیون DNA ایجاد شده در سلول های زایا (اسپرم و تخمک) می تواند به نسل بعدی منتقل شود. این الگوهای متیلاسیون ارثی بر اپی ژنوم جنین در حال رشد تأثیر می گذارد.
  • علائم اپی ژنتیک در اسپرم و تخمک: علائم اپی ژنتیک، از جمله متیلاسیون DNA، در اسپرم و تخمک به ایجاد اپی ژنوم در جنین در حال رشد کمک می کند. این در هنگام لقاح رخ می دهد.
  • تاثیرات محیطی: قرار گرفتن در معرض محیطی، از جمله رژیم غذایی و سموم محیطی، می تواند بر علائم اپی ژنتیک در سلول های زایا تأثیر بگذارد. این تغییرات ممکن است به نسل های بعدی منتقل شود.
  • تأثیر متقابل ژنتیک و اپی ژنتیک: بین عوامل ژنتیکی و اپی ژنتیکی در تعیین وراثت صفات تأثیر متقابل وجود دارد. تغییرات اپی ژنتیکی می تواند بیان ژن ها را تعدیل کند و به تنوع فنوتیپی در بین نسل ها کمک کند.
  • اثرات بر حساسیت به بیماری: وراثت اپی ژنتیک بین نسلی با وراثت استعداد بیماری مرتبط است. تغییرات در الگوهای متیلاسیون DNA ممکن است در خطر ابتلا به برخی بیماری ها در نسل های بعدی نقش داشته باشد.

مهارکننده های DNMT چگونه کار می کنند و پتانسیل آنها در درمان سرطان چیست؟

مهارکننده های DNMT ترکیباتی هستند که آنزیم های DNA متیل ترانسفراز را هدف قرار می دهند و کاربردهای بالقوه ای در درمان سرطان دارند. در اینجا نحوه کار آنها و پتانسیل آنها آمده است:

  • متیل ترانسفرازهای DNA هدف (DNMTs): مهارکننده‌های DNMT، مانند 5-azacytidine و decitabine، آنالوگ‌های نوکلئوزیدی هستند که در طول همانندسازی در DNA ترکیب می‌شوند. پس از گنجاندن، آنها به صورت کووالانسی به DNMT ها متصل می شوند که منجر به غیرفعال شدن آنها می شود.
  • دی متیلاسیون DNA: مهار DNMT ها منجر به کاهش متیلاسیون DNA می شود. این فرآیند منجر به هیپومتیلاسیون جهانی DNA، از جمله دی متیلاسیون پروموترهای ژنی خاص می شود.
  • فعال سازی مجدد ژن های سرکوبگر تومور: هیپرمتیلاسیون نواحی پروموتر اغلب منجر به خاموش شدن ژن های سرکوبگر تومور در سرطان می شود. مهارکننده‌های DNMT می‌توانند این هیپرمتیلاسیون را معکوس کنند و امکان فعال‌سازی مجدد ژن‌های خاموش‌شده را فراهم کنند.
  • القای آسیب DNA و آپوپتوز: مهارکننده های DNMT می توانند آسیب DNA را القا کنند و باعث آپوپتوز در سلول های سرطانی شوند. ادغام این آنالوگ ها در DNA فرآیندهای سنتز و ترمیم طبیعی DNA را مختل می کند.
  • پتانسیل در بدخیمی های هماتولوژیک: مهارکننده‌های DNMT به‌ویژه در بدخیمی‌های خونی مانند سندرم‌های میلودیسپلاستیک (MDS) و لوسمی میلوئید حاد (AML) کارایی نشان داده‌اند. آنها برای درمان این شرایط تایید شده اند.
  • درمان های ترکیبی اپی ژنتیک: مهارکننده های DNMT اغلب در ترکیب با سایر درمان های اپی ژنتیک یا شیمی درمانی معمولی استفاده می شوند. هدف درمان های ترکیبی افزایش اثربخشی درمان و غلبه بر مقاومت است.

آیا الگوهای متیلاسیون (methylation) با قرار گرفتن در معرض سموم محیطی قابل تغییر است؟

بله، قرار گرفتن در معرض سموم محیطی می تواند الگوهای متیلاسیون DNA را تغییر دهد. در اینجا نحوه تأثیر سموم محیطی بر متیلاسیون DNA آمده است:

  • تعامل مستقیم با DNMT ها: برخی از سموم محیطی می توانند به طور مستقیم با آنزیم های DNA متیل ترانسفراز (DNMTs) تعامل داشته باشند و بر فعالیت آنها تأثیر بگذارند. این ممکن است منجر به تغییر در الگوهای متیلاسیون DNA شود.
  • مدولاسیون اپی ژنتیک: سموم محیطی می توانند به عنوان اصلاح کننده های اپی ژنتیک عمل کنند و بر افزودن و حذف گروه های متیل از DNA تأثیر بگذارند. این مدولاسیون می تواند بر بیان ژن های مرتبط با پاسخ های سمی تأثیر بگذارد.
  • متیلاسیون DNA تغییر یافته در مناطق پروموتر: قرار گرفتن در معرض سموم می تواند منجر به هیپرمتیلاسیون یا هیپومتیلاسیون نواحی پروموتور ژن خاص شود. هیپرمتیلاسیون ممکن است ژن های سرکوبگر تومور را خاموش کند، در حالی که هیپومتیلاسیون ممکن است انکوژن ها را فعال کند.
  • تاثیر بر عناصر قابل انتقال: سموم محیطی می توانند بر وضعیت متیلاسیون عناصر قابل انتقال و توالی های DNA مکرر تأثیر بگذارند. عدم تنظیم این عناصر ممکن است به بی ثباتی ژنومی کمک کند.
  • قرار گرفتن در معرض رشد و اثرات مادام العمر: قرار گرفتن در معرض سموم در طول دوره های حیاتی رشد، مانند مراحل پیش از تولد یا مراحل اولیه پس از تولد، می تواند اثرات طولانی مدت بر متیلاسیون DNA داشته باشد. این تغییرات ممکن است در طول زندگی فرد باقی بماند.
  • ارتباط با بیماری: تغییرات متیلاسیون DNA ناشی از سموم محیطی با بیماری های مختلفی از جمله سرطان، اختلالات رشد عصبی و بیماری های قلبی عروقی مرتبط است.
  • تنوع فردی در پاسخ: تأثیر سموم محیطی بر متیلاسیون DNA می تواند در افراد مختلف متفاوت باشد که تحت تأثیر عوامل ژنتیکی، زمان قرار گرفتن در معرض و مدت زمان قرار گرفتن در معرض آن قرار می گیرد.
  • حافظه اپی ژنتیک و اثرات فرا نسلی: قرار گرفتن در معرض سموم محیطی ممکن است یک حافظه اپی ژنتیک ایجاد کند که منجر به تغییراتی در متیلاسیون DNA می شود که می تواند در بین نسل ها منتقل شود و به اثرات بین نسلی کمک کند.

متیلاسیون DNA و سموم محیطی

در سایت healthline در مورد آزمایش متیلاسیون (methylation test) بیشتر بخوانید:

متیلاسیون DNA نمونه ای از یکی از مکانیسم های متعدد اپی ژنتیک است. اپی ژنتیک به تغییراتی در نحوه “خواندن” DNA توسط بدن شما اشاره دارد. آنها توالی DNA واقعی را تغییر نمی دهند. یعنی این تغییرات به طور بالقوه قابل برگشت هستند.

DNA شما از چهار باز به نام‌های سیتوزین، گوانین، آدنین و تیمین تشکیل شده است. یک واحد شیمیایی به نام گروه متیل که حاوی یک اتم کربن و سه اتم هیدروژن است را می توان به سیتوزین اضافه کرد.وقتی این اتفاق می افتد، آن ناحیه از DNA متیله می شود. وقتی آن گروه متیل را از دست می دهید، ناحیه د متیل می شود. متیلاسیون DNA اغلب بیان ژن های خاصی را مهار می کند. این می تواند نحوه عملکرد بدن شما را تغییر دهد و به طور بالقوه بر سلامت شما به طرق مختلف تأثیر بگذارد.

مطالب مرتبط در متااورگانون:

NGS | توالی یابی نسل بعدی | Next-generation sequencing | توالی یابی با توان بالا | High-throughput sequencing

NGS | توالی یابی نسل بعدی | Next-generation sequencing | توالی یابی با توان بالا | High-throughput sequencing

واکنش زنجیره ای پلیمراز (PCR) | Polymerase Chain Reaction

واکنش زنجیره ای پلیمراز (PCR) | Polymerase Chain Reaction

آزمایش تعیین هویت | آزمایش رد ابوت | paternity | آزمایش پدر فرزندی

آزمایش تعیین هویت | آزمایش رد ابوت | paternity | آزمایش پدر فرزندی

آزمایش بیوپسی مایع | DNA تومور در گردش (ctDNA) | Liquid biopsy | سلول های تومور در گردش (CTC) | Circulating Tumor Cell Count

آزمایش بیوپسی مایع | DNA تومور در گردش (ctDNA) | Liquid biopsy | سلول های تومور در گردش (CTC) | Circulating Tumor Cell Count

برچسب ها:

این مقاله را به دوستان خود معرفی کنید

منابع مقاله

  • Amenyah SD, et al. (2020). Influence of nutrients involved in one-carbon metabolism on DNA methylation in adults-a systematic review and meta-analysis.
    https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/31977026/
  • Anderson OS, et al. (2012). Nutrition and epigenetics: An interplay of dietary methyl donors, one-carbon metabolism, and DNA methylation.
    https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0955286312000599
  • Christensen BC, et al. (2010). Breast cancer DNA methylation profiles are associated with tumor size and alcohol and folate intake.
    https://journals.plos.org/plosgenetics/article?id=10.1371/journal.pgen.1001043
  • Choi S-W, et al. (2010). Epigenetics: A new bridge between nutrition and health.
    https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S216183132200552X
  • ElGendy K, et al. (2018). Effects of dietary interventions on DNA methylation in adult humans: systematic review and meta-analysis.
    https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/30355391/
  • Heyn H, et al. (2012). Distinct DNA methylomes of newborns and centenarians.
    https://www.pnas.org/doi/full/10.1073/pnas.1120658109
  • Jasiulionis MG. (2018). Abnormal epigenetic regulation of immune system during aging.
    https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fimmu.2018.00197/full
  • Kurdyukov S, et al. (2016). DNA methylation analysis: Choosing the right method.
    https://www.mdpi.com/2079-7737/5/1/3
  • Lim DH, et al. (2011). DNA methylation: A form of epigenetic control of gene expression.
    https://obgyn.onlinelibrary.wiley.com/doi/pdf/10.1576/toag.12.1.037.27556
  • Nutrition and the epigenome. (n.d.).
    http://learn.genetics.utah.edu/content/epigenetics/nutrition/
  • Office of Dietary Supplements. (2011). Vitamin B12 [Fact sheet].
    https://ods.od.nih.gov/factsheets/VitaminB12-Consumer/
  • Office of Dietary Supplements. (2022). Folate [Fact sheet].
    https://ods.od.nih.gov/factsheets/Folate-Consumer/
  • Office of Dietary Supplements. (2021). Vitamin B6 [Fact sheet].
    https://ods.od.nih.gov/factsheets/VitaminB6-Consumer/
  • Office of Dietary Supplements. (2022). Choline [Fact sheet].
    https://ods.od.nih.gov/factsheets/Choline-Consumer/
  • Reemely M, et al. (2015). Therapeutic perspectives of epigenetically active nutrients.
    https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4439873/
  • Slieker RC, et al. (2015). DNA methylation landscapes of human fetal development.
    https://journals.plos.org/plosgenetics/article?id=10.1371/journal.pgen.1005583
  • What is epigenetics? (2022).
    https://www.cdc.gov/genomics/disease/epigenetics.htm

این مقاله برای شما مفید بود؟

ثبت دیدگاه

Go to Top