آزمایش DNase | آزمایش هیدرولیز DNA

نقش آزمایش DNase یا هیدرولیز DNA در تشخیص گونه های باکتری:

هدف از آزمایش DNase یا هیدرولیز DNA:

دئوکسی ریبونوکلئیک اسید (DNA) یک پلیمر بزرگ از نوکلئوتیدها است که برای ورود به غشای سلولی بسیار بزرگ است. به منظور استفاده از DNA خارجی، سلول های باکتری اگزونزیم هایی (DNases) را در خارج از سلول ترشح می کنند که DNA را به نوکلئوتید هیدرولیز می کند.

سپس نوکلئوتیدها می توانند از طریق پروتئین های حمل و نقل در غشای سلولی حرکت کنند تا مورد استفاده قرار گیرند. سلول می تواند از نوکلئوتیدها برای ساخت اسیدهای نوکلئیک و استفاده به عنوان منبع نیتروژن، فسفات و کربن استفاده کند.

DNaseهای خارج سلولی در زیرمجموعه نسبتاً کوچکی از پروکاریوت ها، از جمله تعدادی از پاتوژن های انسانی گزارش شده است. هیدرولیز DNA با رشد یک ارگانیسم در صفحه DNase Test Agar (تامین مواد مغذی و DNA) و سپس بررسی پلیت برای هیدرولیز آزمایش می شود.

آزمایش هیدرولیز DNA یا آزمایش دئوکسی ریبونوکلئاز (DNase) بنابراین برای تعیین توانایی یک موجود زنده در هیدرولیز DNA و استفاده از آن به عنوان منبع کربن و انرژی برای رشد استفاده می شود. به شناسایی فعالیت دئوکسی ریبونوکلئاز باکتری ها و قارچ ها و به ویژه برای شناسایی استافیلوکوک های بیماری زا کمک می کند.

محیط DNase:

نکته: بعد از اضافه شدن HCl، آگار شفاف شد که نشان داد DNA در حال تجزیه است (الیگونوکلئوتیدها در اسید حل می شوند، اما نمک های DNA نامحلول هستند)

نکته:افزودن رنگ متیل گرین به محیط آگاری که از قبل حاوی اسید دئوکسی ریبونوکلئیک است، یافتن باکتری‌هایی که دئوکسی ریبونوکلئاز را می‌سازند، آسان‌تر می‌کند. وقتی از رنگ استفاده می کنید، لازم نیست از اسید برای نشان دادن کارکرد دئوکسی ریبونوکلئاز استفاده کنید. این بدان معنی است که کلنی ها را می توان خرده کشت یا انکوباتور مجدد کرد.

توجه: در pH 7/3، هنگامی که رنگ متیل گرین به DNA پلیمریزه شده متصل می شود، می توان یک کمپلکس سبز پایدار ایجاد کرد. عمل DNase ساختار DNA را می شکند و متیل گرین آزاد می کند. سبز متیل آزاد در pH 7/3 به خودی خود رنگ خود را از دست می دهد و هاله های بی رنگ در اطراف مستعمرات ایجاد می کند که برای DNase مثبت هستند.

نکته:تولویدین بلو O (TBO) یک رنگ متاکروماتیک است، به این معنی که وقتی با مواد دیگر مخلوط می شود، رنگ آن تغییر می کند. هنگامی که TBO به DNA پلیمریزه شده (محیط تلقیح نشده) متصل می شود، نتیجه یک رنگ آبی سلطنتی است.

هنگامی که DNA تجزیه می شود، TBO به الیگونوکلئوتیدها یا مونوکلئوتیدها متصل می شود که ساختار رنگ و طیف جذب آن را تغییر می دهد و رنگ را صورتی روشن می کند. حلقه‌های صورتی مایل به رز در اطراف کلونی‌هایی که دارای DNase مثبت هستند، که پس‌زمینه آبی دارند، ظاهر می‌شوند. لیور و پاتل گفتند که هنگام آزمایش گونه های کمپیلوباکتر، DNase Agar با TBO بهترین راه برای انجام آن است. همچنین، TBO ممکن است از رشد برخی باکتری های گرم مثبت، از جمله برخی از سویه های استافیلوکوکوس اورئوس، جلوگیری کند.

اساس آزمایش DNase یا هیدرولیز DNA:

این آزمایش برای تعیین توانایی یک موجود زنده در هیدرولیز DNA استفاده می شود. DNase agar یک محیط متمایز است که توانایی یک موجود زنده را برای تولید یک آنزیم خارجی به نام دئوکسی ریبونوکلئاز آزمایش می کند. DNase اندونوکلئازهای خارج سلولی هستند که DNA را می شکافند و نوکلئوتیدها و فسفات آزاد آزاد می کنند. DNase آگار حاوی مواد مغذی برای باکتری ها، DNA و بیشتر متیل گرین به عنوان یک شاخص است. متیل گرین کاتیونی است که به DNA با بار منفی متصل می شود.

دئوکسی ریبونوکلئاز به ارگانیسم هایی که آن را تولید می کنند اجازه می دهد تا DNA را به قطعات کوچکتر تجزیه کنند. هنگامی که DNA تجزیه می شود، دیگر به متیل گرین متصل نمی شود و یک هاله شفاف در اطراف مناطقی که ارگانیسم تولید کننده DNase رشد کرده است ظاهر می شود.

در آگار DNase بدون نشانگر، هیدرولیز DNA با پاکسازی آگار پس از افزودن HCL مشاهده می شود (الیگونوکلئوتیدها در اسید حل می شوند اما نمک های DNA نامحلول هستند). اسید DNA هیدرولیز نشده را رسوب می دهد و محیط را مات می کند. بنابراین، کلنی های تولید کننده DNase، DNA را هیدرولیز می کنند و ناحیه ای شفاف در اطراف رشد ایجاد می کنند.

روش انجام آزمایش DNase یا هیدرولیز DNA:

• تلقیح باید از یک کشت خالص حاصل شود که حداقل برای یک شب روی آگار قلب انفوزیون، بلاد آگار با خون گوسفندی یا در BHI Broth رشد کرده است.
• با استفاده از تلقیح مستقیم، یک خط مستقیم از لبه تا وسط صفحه ایجاد کنید.
• پلیت ها را به مدت 18 تا 24 ساعت در دمای اتاق یا 33 تا 37 درجه سانتیگراد انکوبه کنید.
• پس از انکوبه شدن DNase Test Agar، آن را با HCl یک نرمال پر کنید و به دنبال یک ناحیه شفاف در اطراف خط رشد باشید.
• محیط های آگار برای آزمایش DNase با متیل گرین و آگار آزمایش DNase با تولویدین بلو نیازی به HCl یک نرمال ندارند. 

روش انجام آزمایش DNase 

نتایج مورد انتظار در آزمایش DNase یا هیدرولیز DNA:

آزمایش DNase بدون نشانگر:

• تست مثبت – پس از افزودن HCl یک نرمال، یک ناحیه شفاف در اطراف خط رشد تشکیل می شود، اما بقیه صفحه هنوز کدر است.
• تست منفی – هنگامی که HCl یک نرمال اضافه می شود، هیچ ناحیه شفافی در اطراف خط رشد وجود ندارد و کل صفحه کدر می شود.

آزمایش DNase با متیل گرین:

• تست مثبت – یک صفحه آگار سبز با یک خط رشد و یک ناحیه بی رنگ در اطراف آن.
• تست منفی – هیچ ناحیه ای در اطراف خط رشد وجود ندارد و کل صفحه سبز است.

آزمایش DNase با تولویدین بلو:

• تست مثبت – بقیه صفحه آبی است، اما ناحیه اطراف خط رشد صورتی است.
• تست منفی – هیچ رنگ صورتی در اطراف خط رشد وجود ندارد و کل صفحه آبی است.

محدودیت های آزمایش DNase یا هیدرولیز DNA:

• آگار باید با سوسپانسیون یک کشت آبگوشت جوان (4 ساعته) یا یک کلنی 18 تا 24 ساعته در یک تا دو میلی لیتر سالین تلقیح شود.
• برخی از سویه‌های MRSA نتیجه مثبت نمی‌دهند و برخی از سویه‌های استافیلوکوک کواگولاز منفی مانند استافیلوکوکوس کاپیتیس واکنش مثبت ضعیفی نشان می‌دهند.
• برای موراکسلا و کوکسی های گرم مثبت با آزمایش TBO، تلقیح کم می تواند منجر به آزمایش منفی کاذب شود، زیرا این موجودات ممکن است به خوبی در محیط رشد نکنند.
• HCl یک نرمال برای استافیلوکوک ها باکتری کش است. پس از اعمال HCl، آزمایش باید در عرض 5 دقیقه خوانده شود و نمی توان آن را با انکوباسیون مجدد ادامه داد.
• برخی از استافیلوکوک ها که به تست کواگولاز واکنش نشان نمی دهند ممکن است فقط به تست DNase واکنش ضعیفی نشان دهند.
• هنگام آزمایش باسیل های گرم منفی، بهترین محیط برای استفاده متیل گرین است.

برنامه کنترل کیفی (QC) آزمایش DNase یا هیدرولیز DNA:

• مثبت: استافیلوکوکوس اورئوس
• منفی: استافیلوکوکوس اپیدرمیدیس