آزمایش کوآگولاز | Coagulase test

کوآگولاز (Coagulase) آنزیمی است که توسط برخی از گونه های باکتری استافیلوکوک به ویژه استافیلوکوکوس اورئوس تولید می شود. آنزیم کوآگولاز فیبرینوژن، پروتئین محلول پلاسما را به فیبرین نامحلول تبدیل می کند که منجر به تشکیل لخته می شود. این توانایی لخته شدن پلاسما یک ویژگی مشخصه استافیلوکوکوس اورئوس و برخی گونه های دیگر است که آنها را از سایر استافیلوکوک های کوآگولاز منفی متمایز می کند.

تست کوآگولاز برای افتراق استافیلوکوکوس اورئوس (مثبت) که آنزیم کوآگولاز تولید می کند، از استافیلوکوکوس اپیدرمیس و ساپروفیتیکوس که کوآگولاز تولید نمی کنند (منفی)، یعنی استافیلوکوک کوآگولاز منفی (CONS)، استفاده می شود.

تست های مخصوص استافیلوکوکوس اورئوس

نقش آزمایش کوآگولاز (Coagulase) در تشخیص گونه های باکتری استافیلوکوک به ویژه استافیلوکوکوس اورئوس (S.aureus):

هدف از آزمایش کوآگولاز (Coagulase):

هدف از آزمایش کوآگولاز تعیین این است که آیا یک باکتری، به ویژه در جنس استافیلوکوک، آنزیم کوآگولاز را تولید می کند یا خیر. کوآگولاز یک فاکتور بیماریزای مهم است که توسط باکتری های خاصی، به ویژه استافیلوکوکوس اورئوس تولید می شود. این آزمایش به تمایز بین استافیلوکوک های کوآگولاز مثبت و کوآگولاز منفی کمک می کند.

وجود کوآگولاز به باکتری های خاصی مانند استافیلوکوکوس اورئوس اجازه می دهد تا آبشار لخته شدن را دستکاری کرده و لخته های خون را تشکیل دهند. این توانایی مهم است زیرا باعث فرار از پاسخ های ایمنی میزبان و تسهیل ایجاد عفونت ها می شود. استافیلوکوک های کواگولاز مثبت اغلب بیماریزاتر از گونه های کواگولاز منفی هستند که فاقد این آنزیم هستند.

با انجام تست کوآگولاز ، میکروبیولوژیست ها می توانند استافیلوکوکوس اورئوس را شناسایی کرده و آن را از سایر استافیلوکوک های کواگولاز منفی تشخیص دهند. این اطلاعات برای تشخیص دقیق و درمان مناسب عفونت های استافیلوکوکی بسیار مهم است. علاوه بر این، به درک احتمال بیماریزایی باکتری های جدا شده و ارزیابی شدت عفونت کمک می کند.

ذکر این نکته ضروری است که تست کوآگولاز تنها یکی از چندین آزمایش مورد استفاده در شناسایی و شناسایی باکتری ها است. آزمایش‌های دیگر، مانند آزمایش‌های بیوشیمیایی، تست حساسیت ضد میکروبی و روش‌های مولکولی، اغلب همراه با آزمایش کواگولاز انجام می‌شوند تا درک جامعی از ویژگی‌های باکتری به دست آورند و مناسب‌ترین رویکرد درمانی را تعیین کنند.

ساختار و نحوه عملکرد آنزیم کوآگولاز (Coagulase):

آنزیم کوآگولاز موجود در استافیلوکوکوس اورئوس یک پروتئین ترشحی است که نقش مهمی در پاتوژنز این باکتری دارد. در درجه اول توسط دو ژن به نام‌های coa و vwb کدگذاری می‌شود که دو شکل مختلف کواگولاز تولید می‌کنند: کواگولاز باتد شده و کواگولاز آزاد.

کواگولاز باند، که فاکتور توده کننده (clumping factor) نیز نامیده می شود، به دیواره سلولی باکتری متصل می شود و چسبندگی استافیلوکوکوس اورئوس به بافت میزبان را تسهیل می کند. این ماده با فیبرینوژن، پروتئین پلاسما موجود در خون، تعامل دارد و باعث تشکیل توده ها یا تجمع باکتری ها می شود.

کواگولاز آزاد که به عنوان کواگولاز ترشحی یا خارج سلولی نیز شناخته می شود، شکلی از کواگولاز است که مستقیماً در فعال کردن آبشار انعقادی نقش دارد. این یک آنزیم پروتئاز است که فیبرینوژن، یک پروتئین محلول پلاسما، را به فیبرین نامحلول تبدیل می کند. این فیبرین یک شبکه یا لخته تشکیل می دهد که به استافیلوکوکوس اورئوس کمک می کند تا از سیستم ایمنی فرار کند، عفونت را محلی کند و یک محیط محافظتی برای رشد باکتری ایجاد کند.

نقش آنزیم کوآگولاز (Coagulase)

فعال سازی آبشار انعقادی توسط کواگولاز شامل مراحل زیر است:

• تعامل با پروترومبین: کواگولاز آزاد به پروتئین پلاسما پروترومبین متصل می شود و آن را فعال می کند که به عنوان فاکتور انعقادی II نیز شناخته می شود. این اتصال با وجود یک کوفاکتور به نام فاکتور فون ویلبراند (vWF) که توسط ژن vwb کدگذاری می‌شود، تسهیل می‌شود.
• تبدیل پروترومبین به ترومبین: کواگولاز پس از اتصال به پروترومبین، آن را به صورت آنزیمی می شکافد و آن را به شکل فعال خود یعنی ترومبین تبدیل می کند. ترومبین یک آنزیم کلیدی در آبشار انعقادی است.
• فعال شدن فیبرینوژن: ترومبین بر روی پروتئین پلاسما دیگری به نام فیبرینوژن که به عنوان فاکتور لخته شدن I نیز شناخته می شود، عمل می کند.
•  پلیمریزاسیون فیبرین: مونومرهای فیبرین محلول به طور خود به خود پلیمریزه می شوند و شبکه ای از رشته های فیبرین نامحلول را تشکیل می دهند. این شبکه پایه یک لخته خون را تشکیل می دهد.

با فعال کردن آبشار انعقادی، آنزیم کواگولاز در استافیلوکوکوس اورئوس باعث تشکیل لخته های خون می شود. این لخته ها می توانند به باکتری ها کمک کنند تا از پاسخ های ایمنی فرار کنند، مانعی برای نفوذ آنتی بیوتیک ایجاد کنند و عفونت های موضعی ایجاد کنند.

شایان ذکر است که استافیلوکوک های کواگولاز منفی مانند استافیلوکوکوس اپیدرمیدیس فاقد فعالیت کواگولاز هستند. بنابراین، توانایی استافیلوکوکوس اورئوس در تولید کواگولاز یک عامل بیماریزای مهم است که آن را از سایر گونه های استافیلوکوک متمایز می کند.

اساس آزمایش کوآگولاز (Coagulase):

نوع کواگولاز باند شده:

آزمایش کواگولاز باند شده بر اساس توانایی کواگولاز مرتبط با سطح باکتری (فاکتور توده کننده یا clumping factor) با فیبرینوژن است. در این آزمایش، یک سوسپانسیون کشت باکتریایی با سوسپانسیون ذرات لاتکس پوشیده شده با فیبرینوژن مخلوط می شود. اگر باکتری کواگولاز متصل تولید کند، آنزیم به ذرات لاتکس پوشیده شده با فیبرینوژن متصل می شود و باعث جمع شدن یا آگلوتیناسیون می شود. آگلوتیناسیون ذرات لاتکس یک نتیجه مثبت برای تولید کواگولاز متصل است که نشان دهنده وجود استافیلوکوکوس اورئوس است.

 نوع کواگولاز آزاد:

آزمایش کواگولاز آزاد برای تشخیص شکل ترشح شده یا خارج سلولی کواگولاز انجام می شود. این آزمایش معمولا بر اساس توانایی کواگولاز آزاد برای فعال کردن آبشار انعقادی و تبدیل فیبرینوژن به فیبرین است. اگر باکتری کواگولاز آزاد تولید کند، آنزیم بر فیبرینوژن اثر می گذارد و منجر به تشکیل لخته قابل مشاهده می شود. وجود لخته نشان دهنده نتیجه مثبت برای تولید کواگولاز آزاد است که نشان دهنده وجود استافیلوکوکوس اورئوس است.

کواگولازهای آزاد در مقایسه با کواگولازهای متصل متفاوت هستند، این مکانیسم ایجاد لخته مستلزم فعال ­سازی کوآگولاز به وسیله یک فاکتور واکنش گر با کوآگولاز (CRF) پلاسمایی است که یک شکل تغییریافته یا مشتق­ سازی شده ملکول ترومبین در جهت تولید یک کمپلکس کوآگولاز- CRF است. پلاسمای خرگوش به لوله اضافه می شود که به عنوان یک عامل اتصال عمل می کند. پس از آن، کمپلکس با فیبرینوژن واکنش می دهد و لخته فیبرین را در یک لوله آزمایش تشکیل می دهد.

توجه به این نکته مهم است که کواگولاز متصل و آزاد توسط استافیلوکوکوس اورئوس تولید می شود، اما آنها اشکال مختلفی از آنزیم را نشان می دهند. کواگولاز متصل شده با سطح سلولی باکتری مرتبط است و چسبندگی را تقویت می کند، در حالی که کواگولاز آزاد ترشح می شود و مستقیماً در آبشار انعقاد دخالت دارد. بنابراین، هر دو شکل کواگولاز می توانند به روش های مختلف در بیماریزایی استافیلوکوکوس اورئوس نقش داشته باشند.

نحوه انجام آزمایش کوآگولاز (Coagulase):

روش تست اسلایدی کواگولاز (برای تشخیص کواگولاز متصل):

• قطره ­ای از پلاسما (ترجیحاً پلاسمای خرگوش با EDTA) را بر روی یک اسلاید شیشه ­ای تمیز و خشک قرار دهید.
• قطره­ای از آب مقطر یا سالین (سرم فیزیولوژی) را در کنار قطره پلاسما به عنوان کنترل قرار دهید.
• با استفاده از یک لوپ، سیم مستقیم (آنس) یا اپلیکاتور چوبی، قسمتی از کلنی جدا شده مورد آزمایش را در هر کدام از قطرات، امولسیفیه کنید؛ تلقیح را ابتدا در آب مقطر یا سالین انجام دهید. سعی کنید یک سوسپانسیون یکنواخت حاصل شود.
• به خوبی با یک اپلیکاتور چوبی سوسپانسیون را مخلوط کنید.
• اسلاید را به آرامی به جلو و عقب خم کنید تا هرگونه تغییر قابل مشاهده مانند کلوخه شدن یا لخته شدن را مشاهده کنید.
• نتیجه مثبت با تشکیل لخته قابل مشاهده یا آگلوتیناسیون در مدت کوتاهی، معمولاً در عرض چند ثانیه (10 ثانیه)، نشان داده می شود. تشکیل لخته به دلیل تبدیل فیبرینوژن به فیبرین نامحلول توسط آنزیم کواگولاز اتفاق می افتد.

روش تست اسلایدی کواگولاز

توجه: تمامی آزمایش­ های اسلایدی مثبت می ­بایست با استفاده از آزمایش لوله ­ای مورد تأیید قرار گیرند.

روش تست لوله ای کواگولاز (برای تشخیص کواگولاز آزاد):

• چندین کلنی را در 0/5 میلی لیتر پلاسمای خرگوش رقیق شده به نسبت یک به پنج با EDTA مخلوط نموده و یک سوسپانسیون شیری تولید کنید.
•  لوله رادر 37 درجه سانتیگراد برای 4 ساعت انکوبه کنید.
• تولید لخته را بررسی کنید.

توجه: آزمایش ممکن است در 4 ساعت مثبت بوده و بعد از 24 ساعت به منفی تبدیل شود. در صورتی که نتیجه بعد از 4 ساعت منفی یود، یک شب در حرارت اتاق انکوبه کنید و دوباره از نظر ایجاد لخته بررسی کنید.

روش تست لوله ای کواگولاز

یک نتیجه مثبت با وجود لخته قابل مشاهده در پلاسما در زمان انکوباسیون مشخص شده نشان داده می شود. تشکیل لخته به دلیل تبدیل فیبرینوژن به فیبرین توسط آنزیم کواگولاز تولید شده توسط استافیلوکوکوس اورئوس رخ می دهد.

یک نتیجه منفی با عدم تشکیل لخته (در 24 ساعت در دمای 37 درجه سانتیگراد) قابل مشاهده در پلاسما در زمان انکوباسیون مشخص شده نشان داده می شود. پس از 24 ساعت در دمای 35 درجه سانتیگراد لخته ایجاد نمی شود، اما پس از افزودن 1 یا 2 قطره کلسیم کلرید 5 درصد به لوله، لخته ایجاد می شود.

لیست ارگانیسم های مثبت و منفی تست کوآگولاز

محدودیت های تست کوآگولاز:

• تست اسلاید باید خیلی سریع خوانده شود، زیرا ممکن است مثبت کاذب رخ دهد و آگلوتیناسیون خودبخودی ممکن است رخ دهد.
• اطمینان حاصل کنید که در طول مخلوط کردن به جای آب از سرم فیزیولوژی استفاده کنید.
• ارگانیسم مورد استفاده در روش آزمایش اسلاید، نباید از محیط های پر نمک به عنوان مثال مانیتول نمک آگار گرفته شود، زیرا محتوای نمک بالا می تواند منجر به نتایج مثبت کاذب شود.
• مخلوط کردن بیش از حد می تواند منجر به از بین رفتن لخته شود.
• روش تست لوله در مقایسه با روش تست اسلاید قابل اعتمادتر است.
• نمونه ها باید برای لخته شدن ظرف 24 ساعت مشاهده شوند. این به این دلیل است که برخی از سویه هایی که کواگولاز تولید می کنند، آنزیمی به نام فیبرینولیزین نیز تولید می کنند که می تواند لخته را حل کند. بنابراین، عدم وجود لخته بعد از 24 ساعت تضمینی برای تشکیل لخته نیست.
• تشکیل لخته در 12 ساعت و متعاقباً ناپدید شدن لخته در 24 ساعت می تواند به اصطلاح منفی کاذب ایجاد کند اگر آزمایش فقط در زمان 24 ساعت مشاهده شود.
• برخی از سویه های استافیلوکوکوس اورئوس وجود دارند که ممکن است فاقد فعالیت کواگولاز یا کاهش یافته باشند. این سویه‌های غیر معمول ممکن است نتیجه آزمایش کواگولاز مثبت ایجاد نکنند، حتی اگر هنوز هم می‌توانند باعث عفونت شوند. بنابراین، تنها با تکیه بر آزمایش کواگولاز ممکن است شناسایی این سویه ها از بین برود.
• آزمایش کواگولاز به خودی خود اطلاعاتی در مورد سویه یا زیرگروه خاص استافیلوکوکوس اورئوس ارائه نمی دهد. این فقط وجود یا عدم وجود فعالیت کواگولاز را نشان می دهد. برای تمایز بیشتر سویه‌ها، آزمایش‌های اضافی مانند تایپ مولکولی یا سایر آزمایش‌های بیوشیمیایی ممکن است ضروری باشد.

برنامه کنترل کیفی (QC) آزمایش کوآگولاز (Coagulase):

• مثبت: استافیلوکوکوس اورئوس (ATCC25923)
• منفی: استافیلوکوکوس ایپدرمیدیس (ATCC12228)

در سایت LaboratoryTests.org در مورد آزمایش کوآگولاز بیشتر بخوانید:

کواگولاز آنزیمی است که به صورت کونژوگه با اجزای طبیعی پلاسما برای تبدیل فیبرینوژن به فیبرین عمل می کند و باعث لخته شدن پلاسما می شود. این آنزیم نشانگر خوبی از پتانسیل بیماری زایی استافیلوکوکوس اورئوس است. از آنجایی که 97 درصد سویه های استافیلوکوکوس اورئوس مثبت بودن کواگولاز را اثبات کرده اند، آزمایش کواگولز برای افتراق استافیلوکوکوس اورئوس از سایر کوکسی های گرم مثبت و کاتالاز مثبت مفید است.