آزمایش مصرف سیترات توسط باکتری ها | Citrate utilization test | آزمایش سیمون سیترات

آزمایش استفاده از سیترات (Citrate) یک آزمایش بیوشیمیایی رایج است که برای شناسایی باکتری ها بر اساس توانایی آنها در استفاده از سیترات به عنوان تنها منبع کربن و انرژی استفاده می شود. این آزمایش بر اساس توانایی برخی باکتری ها برای تولید آنزیمی به نام سیترات پرمئاز است که می تواند سیترات را به پیروات تبدیل کنند و پیروات وارد سیکل متابولیک می­شود و انرژی تولید می­ کنند. آزمایش استفاده از سیترات اغلب همراه با سایر آزمایش‌ها، مانند آزمایش‌های IMViC (ایندول، متیل رد، ووگ-پروسکاور و سیترات)، برای تمایز بین باسیل های اعضای خانواده انتروباکتریاسه استفاده می‌شود.

نقش آزمایش استفاده از سیترات (Citrate) در تشخیص خانواده انتروباکتریاسه (Enterobacteriaceae):

هدف از آزمایش سیترات (Citrate):

آزمایش مصرف سیترات توسط باکتری ها روش رایجی است که برای تمایز بین گونه های مختلف باکتری مخصوصا، باسیل های اعضای خانواده انتروباکتریاسه استفاده می‌شود. از این آزمایش برای تعیین توانایی یک ارگانیسم در مصرف سیترات سدیم به عنوان تنها منبع کربن و املاح معدنی آمونیوم به عنوان تنها منبع نیتروژن استفاده می­شود. این توانایی به دلیل وجود آنزیمی به نام سیترات لیاز است که سیترات را به ترکیبات دیگری تجزیه می کند که می تواند برای انرژی و رشد سلول استفاده شود.

شناخته شده ترین آزمایش برای استفاده از سیترات، آزمایش سیمون سیترات (Simmons citrate) است که در آن یک باکتری بر روی یک محیط حاوی سیترات به عنوان تنها منبع کربن رشد می کند. اگر باکتری بتواند از سیترات به عنوان منبع کربن استفاده کند، رشد می کند و محصولات جانبی قلیایی تولید می کند که باعث می شود نشانگر pH بروم تیمول بلو از سبز به آبی تغییر رنگ دهد. آزمایش سیمون سیترات (Simmons citrate) معمولاً در میکروبیولوژی بالینی برای شناسایی باکتری‌های بیماری‌زای خاص مانند اعضای خانواده انتروباکتریاسه که توانایی استفاده از سیترات را دارند، استفاده می‌شود.

چندین باکتری توانایی استفاده از سیترات را به عنوان منبع کربن دارند. برخی از باکتری های سیترات مثبت عبارتند از:

• کلبسیلا
• انتروباکتر
• سیتروباکتر
• پروویدنسیا
• پروتئوس
• سراتیا
• ویبریو کلرا
• سودوموناس
• سالمونلا انتریتیدیس
• اعضای زیرجنس سالمونلا II، III و IV

این باکتری ها به دلیل وجود آنزیم سیتراز و سایر مسیرهای متابولیک ضروری می توانند از سیترات به عنوان تنها منبع کربن استفاده کنند. آزمایش استفاده از سیترات به تمایز این باکتری ها از باکتری های سیترات منفی مانند اشریشیا کلی کمک می کند که در شرایط هوازی نمی توانند از سیترات به عنوان منبع کربن استفاده کنند.

اساس آزمایش سیترات (Citrate):

سیترات آگار برای آزمایش توانایی ارگانیسم در استفاده از سیترات به عنوان منبع انرژی استفاده می شود. محیط حاوی سیترات به عنوان تنها منبع کربن و نمک های آمونیوم معدنی (NH4H2PO4) به عنوان تنها منبع نیتروژن است.

باکتری هایی که می توانند روی این محیط رشد کنند، آنزیمی به نام سیترات پرمئاز تولید می کنند که قادر به تبدیل سیترات به پیرووات است. سپس پیرووات می تواند برای تولید انرژی وارد چرخه متابولیک ارگانیسم شود. رشد نشان دهنده استفاده از سیترات، یک متابولیت میانی در چرخه کربس است.

اساس آزمایش سیترات (Citrate)

هنگامی که باکتری‌ها سیترات را متابولیزه می‌کنند، نمک‌های آمونیوم به آمونیاک تجزیه می‌شوند که قلیاییت را افزایش می‌دهد. تغییر pH نشانگر آبی برومتیمول در محیط را از سبز به آبی بالاتر از pH 7/6 تبدیل می کند.

کریستنسن یک محیط آزمایش سیترات جایگزین ایجاد کرد که به ارگانیسم نیازی به استفاده از سیترات به عنوان تنها منبع کربن ندارد. محیط کریستنسن حاوی پپتون و سیستئین است. بنابراین باکتری های سیترات منفی نیز می توانند در این محیط رشد کنند. یک واکنش مثبت نشان می دهد که ارگانیسم می تواند از سیترات استفاده کند اما نه لزوما به عنوان تنها منبع کربن.

آمونیوم دی هیدروژن فسفات تنها منبع نیتروژن است. دی پتاسیم فسفات به عنوان یک بافر عمل می کند. کلرید سدیم تعادل اسمزی محیط را حفظ می کند. سیترات سدیم تنها منبع کربن در این محیط است. سولفات منیزیم یک کوفاکتور برای انواع واکنش های متابولیکی است. ارگانیسم هایی که قادر به استفاده از آمونیوم دی هیدروژن فسفات و سیترات هستند بدون محدودیت در این محیط رشد می کنند. اگر بتوان از سیترات استفاده کرد، میکروب محصولات جانبی قلیایی/پایه را انباشته خواهد کرد.

هنگامی که باکتری‌ها سیترات را متابولیزه می‌کنند، نمک‌های آمونیوم به آمونیاک تجزیه می‌شوند که pH را افزایش می‌دهد. تغییر pH نشانگر بروم تیمول بلو در محیط را از سبز به آبی بالاتر از pH 7/6 تبدیل می کند.

نحوه آماده سازی محیط سیمون سیترات (Citrate):

• نمک های بالا را در آب دیونیزه حل کنید.
• pH را روی 6/9 تنظیم کنید.
• آگار و بروموتیمول بلو را اضافه کنید.
• به آرامی با مخلوط کردن حرارت دهید تا بجوشد تا آگار حل شود.
• 4.0 تا 5.0 میلی لیتر را در لوله های 16 میلی متری بریزید.
• اتوکلاو در دمای 121 درجه سانتیگراد تحت فشار 15 psi به مدت 15 دقیقه انجام شود
• در حالت مایل (شیب بلند، انتهای کم عمق) خنک کنید.
• لوله ها باید در یخچال نگهداری شوند تا از ماندگاری 6 تا 8 هفته اطمینان حاصل شود.
• محیط تلقیح نشده به دلیل pH نمونه و آبی برموتیمول، سبز جنگلی عمیق خواهد بود.

روش انجام آزمایش سیترات (Citrate):

•  از طریق تماس نوک سوزن با کلنی 18 تا 24 ساعته، یک تلقیح سبک بر روی سطح شیب­دار آگار سیمون سیترات انجام دهید. نیازی به تلقیح در انتهای لوله نیست. تلقیح را از کشت مایع انجام ندهید، زیرا تلقیح بسیار سنگین خواهد بود.
• می توانید تا 7 روز در 35 تا 37 درجه سانتیگراد انکوبه کنید.
•  تولید رنگ آبی که نشانه قلیایی شدن است را بررسی کنید.

تفسیر نتیجه آزمایش استفاده از سیترات:

نتایج مورد انتظار آزمایش استفاده از سیترات

• واکنش مثبت: رشد بر روی محیط، همراه یا بدون تغییر در رنگ نشانگر. تغییر رنگ نشانگر ناشی از تولید اسید یا قلیا در هنگام رشد ارگانیسم مورد آزمایش بر روی محیط می­باشد. رشد معمولاً سبب می ­شود تا نشانگر برم تیمول بلو از سبز به آبی تغییر رنگ دهد. به عنوان مثال: سالمونلا، ادواردسیلا، سیتروباکتر، کلبسیلا، انتروباکتر، سراتیا، پروویدنسیا و غیره.
• واکنش منفی: بدون رشد و بدون تغییر رنگ. شیب سبز باقی می ماند. به عنوان مثال: اشریشیا، شیگلا، مورگانلا، یرسینیا و غیره.

محدودیت های آزمایش سیترات (Citrate):

• مهم است که هیچ ماده مغذی را به محیط سیترات منتقل نکنید زیرا این امر منجر به آزمایشات مثبت کاذب می شود.
• برخی از ازرگانیسم ها قادر به رشد در سیترات هستند و تغییر رنگ ایجاد نمی کنند. رشد به عنوان یک آزمایش استفاده از سیترات مثبت در نظر گرفته می شود، حتی در صورت عدم وجود تغییر رنگ.
• تست هایی که نتایج مبهم دارند باید تکرار شوند.
• واکنش های این محیط به تنهایی برای شناسایی در سطح گونه کافی نیست.
• تلقیح باید از یک کشت خالص و یک شبه رشد کرده روی یک محیط جامد باشد و نه از سوسپانسیون براث.

برنامه کنترل کیفی (QC) آزمایش سیترات (Citrate):

• سیترات مثبت: کلبسیلا پنومونیه ATCC 13883 (رشد؛ رنگ آبی)
• سیترات منفی: اشریشیا کلی ATCC 25922 (بدون رشد یا اثری از رشد)

در سایت Microbiology Note در مورد آزمایش مصرف سیترات بیشتر بخوانید:

آزمایش سیترات سیمونز به صورت مایل (شیب دار) انجام می شود، زیرا O2 برای استفاده از سیترات ضروری است. در این روش، اگر ارگانیسم آزمایشی شروع به استفاده از سیترات برای منابع کربن و انرژی کند، روی سیمون سیترات آگار رشد می کند. در نتیجه منجر به افزایش pH محیط می شود و نشانگر pH تغییر رنگ می دهد.