آزمایش بایل اسکولین | Bile Esculin Test

آزمایش بایل اسکولین (Bile Esculin) بر اساس توانایی انتروکوک در هیدرولیز اسکولین، یک ترکیب گلیکوزیدی، در حضور صفرا است. در این آزمایش، نمونه ای از باکتری بر روی محیط کشت حاوی اسکولین و صفرا تلقیح می شود. اگر باکتری ها قادر به هیدرولیز اسکولین باشند، محیط به دلیل تشکیل رنگدانه قهوه ای تیره به نام اسکولتین سیاه می شود. این نشان دهنده نتیجه آزمایش مثبت است و وجود انتروکوک را نشان می دهد.

آزمایش بایل اسکولین در تشخیص باکتری ها

هدف از آزمایش بایل اسکولین:

هدف از آزمایش بایل اسکولین، تشخیص انتروکوکوس از سایر استرپتوکوکوس‌های گروه بوویس و افتراق بین انتروکوکوس و استرپتوکوکوس گروه D از استرپتوکوکوس ­های ویریدنس غیر گروه D می­ باشد.

انتروکوک ها گروهی از باکتری ها هستند که می توانند باعث ایجاد طیف وسیعی از عفونت ها از جمله عفونت های دستگاه ادراری، اندوکاردیت و باکتریمی در انسان شوند. برخی از گونه های انتروکوک نیز از علل مهم عفونت های بیمارستانی هستند.

انتروکوکوس

استرپتوکوک های گروه بوویس، مانند استرپتوکوکوس بوویس و استرپتوکوکوس اکینوس، می توانند ساکنان عادی دستگاه گوارش در انسان و حیوانات باشند، اما با عفونت هایی مانند باکتریمی و اندوکاردیت نیز همراه هستند. استرپتوکوکوس ­های ویریدنس غیر گروه D گروه متنوعی از باکتری ها هستند که معمولاً در حفره دهان و دستگاه تنفسی فوقانی یافت می شوند، اما برخی از گونه ها نیز می توانند باعث عفونت هایی مانند اندوکاردیت و باکتریمی شوند.

آزمایش بایل اسکولین به شناسایی گونه های انتروکوکوس با تشخیص توانایی آنها در هیدرولیز اسکولین در حضور صفرا کمک می کند. از آنجایی که باکتری های غیر انتروکوک معمولاً قادر به هیدرولیز اسکولین نیستند، نتیجه آزمایش مثبت نشان دهنده وجود انتروکوک است. این اطلاعات می تواند برای تشخیص و درمان عفونت های ناشی از انتروکوک و سایر باکتری های گروه بوویس مفید باشد.

اساس آزمایش بایل اسکولین:

باکتری­ های گرم مثبت، به غیر از برخی استرپتوکوکوس‌ها و انتروکوکوس ­ها، توسط صفرا (بایل) موجود در این محیط مهار می­ شوند. در صورتی که استرپتوکوکوس‌ها و انتروکوکوس­ ها در حضور صفرای 40 درصد قادر به رشد باشند و اسکولین را هیدرولیز کنند، آنگاه در حضور معرف، یعنی سیترات آمونیوم فریک (آهن)، تولید یک رنگ قهوه­ ای تیره می­ کنند. این رنگ قهوه ­ای تیره حاصل ترکیبی از اسکولین (محصول انتهایی هیدرولیز اسکولین) با یون­ های فریک در جهت تولید یک کمپلکس فنلی آهن می ­باشد.

Esculin + Acid        → β-D-glucose + Esculetin

Esculetin + Fe3+    → Dark Brown Color

آزمایش بایل اسکولین با بهره‌گیری از این واقعیت کار می‌کند که گونه‌های انتروکوک می‌توانند سطوح بالایی از نمک‌های صفراوی را که در محیط موجود است، تحمل کنند، در حالی که سایر استرپتوکوک‌ها به نمک‌های صفراوی حساس‌تر هستند. وجود نمک های صفراوی در محیط به سرکوب رشد باکتری های غیر انتروکوک کمک می کند و یک محیط انتخابی برای رشد انتروکوک فراهم می کند. افزودن اسکولین به محیط، امکان تشخیص انتروکوکوس را با ایجاد بستری برای واکنش هیدرولیز فراهم می کند.

نکته: حدود 30 درصد از استرپتوکوک های ئیریدنس بایل اسکولین مثبت هستند.

محیط مورد نیاز برای آزمایش بایل اسکولین:

محیط کشت بایل اسکولین آگار تهیه شده در پلیت یا در لوله بصورت شیب دار. این محیط حاوی نمک های صفراوی، اسکولین و سیترات فریک است.

روش انجام آزمایش بایل اسکولین:

روش لوله ای:

• با استفاده از حلقه استریل، یک یا دو کلنی را از یک کشت 18 تا 24 ساعته انتخاب کنید.
• روی سطح شیب محیط اسکولین صفراوی با حرکت S شکل تلقیح کنید.
• لوله تلقیح شده را به مدت 24 ساعت در دمای 35 تا 37 درجه سانتیگراد انکوبه کنید.
• نتیجه را مشاهده کنید.

آزمایش بایل اسکولین به روش لوله ای

روش دیسک:

• دیسک را با یک قطره آب مقطر مرطوب کنید.
• با استفاده از یک حلقه استریل، دو یا سه کلنی جدا شده را از یک کشت یک شبه انتخاب کنید.
• روی دیسک تلقیح کنید.
• اجازه دهید به مدت 10 دقیقه در دمای اتاق واکنش نشان دهد.
• دیسک را برای ایجاد رنگ قهوه ای تیره یا سیاه مشاهده کنید.

آزمایش بایل اسکولین به روش دیسک

نتایج مورد انتظار:

در روش لوله ای:

• مثبت: سیاه شدن بیش از نیمی از آگار، در صورت استفاده از محیط حاوی سیترات آمونیوم آهن.
• منفی: سیاه نشدن محیط

نکته: در مورد براث اسکولین بدون سیترات آهن، آزمایش مثبت به معنای سیاه شدن آبگوشت پس از افزودن معرف فریک یا از بین رفتن فلورسانس محیط است.

در روش دیسک:

• تست دیسک مثبت: ایجاد رنگ قهوه ای تیره یا سیاه.
• تست دیسک منفی: بی رنگ می ماند.

محدودیت های آزمایش بایل اسکولین:

• برخی از میکروارگانیسم ها مانند اشریشیا کلی دارای β-گلوکوزیداز هستند و پس از انکوباسیون طولانی مدت در این آزمایش واکنش نشان می دهند. اگر از این آزمایش فقط برای تشخیص تولید کننده های بتا گلوکوزیداز استفاده می شود، نباید از انکوباسیون طولانی مدت استفاده کرد.
• H2S که توسط چندین موجود زنده در طول متابولیسم تولید می شود، می تواند با آهن واکنش می دهد و کمپلکس سیاه تولید می کند که در تفسیر تست هیدرولیز اسکولین اختلال ایجاد می کند.
• اگر تلقیح بیش از حد زیاد باشد یا غلظت صفرا کمتر از 40 درصد باشد، استرپتوکوک‌های گروه ویریدنس غیر از استرپتوکوک بوویس می‌توانند واکنش مثبتی روی بایل اسکولین آگار نشان دهند.
• تلقیح سنگین روی بایل اسکولین آگار ممکن است باعث شود که تفسیر تست بایل اسکولین برای خواندن با مشکل مواجه شود. تلقیح اضافی توانایی صفرا را برای مهار رشد سایر ارگانیسم های گرم مثبت که ممکن است اسکولین را هیدرولیز کنند، کاهش می دهد.
• محیط بایل اسکولین آگار باید حاوی 40 درصد بایل باشد. محیط کشت های ساخته شده توسط بعضی سازندگان، حاوی مقدار کمتری است که می تواند باعث ایجاد جواب های نا درست گردد.

برنامه کنترل کیفی (QC) آزمایش بایل اسکولین:

• مثبت: انتروکوکوس فکالیس (ATCC19433)- رشد رسوب سیاه رنگ
• منفی: اشریشیاکلای (ATCC25922)- رشد عدم تغییر رنگ

در سایت microbiologyinfo.com در مورد آزمایش بایل اسکولین (Bile Esculin) بیشتر بخوانید:

برای این آزمایش از Bile Esculin agar (BEA) استفاده می شود. BEA یک محیط انتخابی و افتراقی است که احتمالاً برای شناسایی انتروکوک ها و استرپتوکوک های گروه D بر اساس توانایی ارگانیسم در هیدرولیز اسکولین استفاده می شود. اسکولین آگار صفراوی حاوی اکسی گال (نمک های صفراوی، اولین ترکیبات انتخابی) برای مهار رشد سایر ارگانیسم های گرم مثبت به غیر از انتروکوک و استرپتوکوک های گروه D است. حاوی سدیم آزید (دومین ترکیبات انتخابی) برای مهار رشد ارگانیسم های گرم منفی است.

همچنین حاوی مواد مغذی اسکولین و سیترات فریک است. اسکولین (مواد متمایز) یک ترکیب فلورسنت است و هیدرولیز آن را می توان با از دست دادن فلورسانس مشاهده کرد. دیسک اسکولین صفراوی برای تشخیص سریع هیدرولیز اسکولین در حضور صفرا برای افتراق استرپتوکوک های گروه D از استرپتوکوک های غیر گروه D استفاده می شود.