آزمایش آمینو اسید دکربوکسیلاز | Amino Acid Decarboxylase Test

سه آنزیم دکربوکسیلاز اسید آمینه وجود دارد که به طور معمول برای آنها آزمایش انجام می شود – آرژنین دکربوکسیلاز، اورنیتین دکربوکسیلاز و لیزین دکربوکسیلاز. تولید لیزین، آرژنین، اورنیتین دکربوکسیلاز توسط اعضای مختلف انتروباکتریاسه یک پارامتر مهم برای سایر آزمایش‌های بیوشیمیایی برای تمایز باکتری‌ها در گروه‌های نزدیک ارائه می‌کند.

نقش آزمایش آمینو اسید دکربوکسیلاز در تشخیص اعضای مختلف انتروباکتریاسه:

هدف از انجام آزمایش آمینو اسید دکربوکسیلاز:

هدف از آزمایش آمینو اسید دکربوکسیلاز تعیین توانایی میکروارگانیسم ها برای تولید آنزیم دکربوکسیلاز است که حذف گروه کربوکسیل (COOH-) از اسیدهای آمینه خاص را کاتالیز می کند. با انجام این آزمایش، میکروبیولوژیست ها می توانند گونه های مختلف باکتری را بر اساس قابلیت دکربوکسیلاسیون آنها شناسایی و تمایز قائل شوند.

آزمایش آمینو اسید دکربوکسیلاز اطلاعاتی در مورد قابلیت های متابولیکی باکتری های مورد آزمایش ارائه می دهد. برخی از باکتری ها توانایی دکربوکسیله کردن اسیدهای آمینه خاص را دارند، در حالی که برخی دیگر این توانایی را ندارند. این ویژگی می تواند به عنوان یک ابزار تشخیصی برای کمک به شناسایی گونه های باکتریایی استفاده شود.

آزمایش آمینو اسید دکربوکسیلاز به ویژه در تمایز بین اعضای خانواده انتروباکتریاسه که شامل بسیاری از باکتری‌های مرتبط بالینی مانند اشریشیا کلی، سالمونلا و گونه‌های شیگلا است، مفید است. این موجودات را می توان بر اساس توانایی آنها در دکربوکسیله کردن اسیدهای آمینه خاص مانند لیزین، آرژنین و اورنیتین تشخیص داد.

آزمایش آمینو اسید دکربوکسیلاز معمولاً همراه با سایر آزمایش های بیوشیمیایی برای ایجاد مشخصات میکروارگانیسم مورد بررسی استفاده می شود. با ترکیب نتایج آزمایش های متعدد، میکروبیولوژیست ها می توانند شناسایی دقیق تری از گونه های باکتریایی مورد بررسی به دست آورند.

اساس آزمایش آمینو اسید دکربوکسیلاز:

دکربوکسیلازها گروهی از آنزیم‌های اختصاصی سوبسترا هستند که قادر به واکنش با بخش کربوکسیل (COOH-) اسیدهای آمینه، تشکیل آمین‌های واکنش‌دهنده قلیایی و دی اکسید کربن محصول جانبی هستند. برخی از میکروارگانیسم ها دارای چنین آنزیمی هستند که امکان تشخیص آنها را فراهم می کند.

بنابراین آمینو اسید دکربوکسیلاز توانایی آنزیمی (دکربوکسیلاز) ارگانیسم را برای دکربوکسیله کردن (یا هیدرولیز) یک اسید آمینه برای تشکیل یک آمین اندازه گیری می کند. دکربوکسیلاسیون یا هیدرولیز اسید آمینه منجر به pH قلیایی می شود. افزایش pH محیط با تغییر رنگ نشانگرهای pH بنفش برم کرزول و قرمز کرزول موجود که منجر به تغییر رنگ از نارنجی به بنفش می شود، تشخیص داده می شود.

• آزمایش آمینو اسید دکربوکسیلاز برای تعیین تولید دکربوکسیلاز و دکربوکسیلاسیون اسید آمینه در باکتری ها به ویژه در خانواده گونه های انتروباکتریاسه استفاده می شود.
• از آزمایش آمینو اسید دکربوکسیلاز می توان برای تعیین اینکه آیا باکتری قادر به تولید دی هیدرولاز یا دکربوکسیلاز است استفاده کرد. این آنزیم ها برای حذف گروه کربوکسیل اسیدهای آمینه و تشکیل آمین ها استفاده می شوند.
• دکربوکسیلازها برای حذف گروه های کربوکسیل از اسیدهای آمینه مانند لیزین اورنیتین استفاده می شود، در حالی که دی هیدرولاز برای دکربوکسیلاسیون آرژنین، علاوه بر دکربوکسیلاز استفاده می شود.
• محیط دکربوکسیلاز از عصاره گوشت گاو و هضم‌های پپتیک بافت‌های حیوانی تشکیل شده است که مواد مغذی نیتروژنی را برای ارگانیسم‌ها فراهم می‌کند.
• محیط حاوی گلوکز، یک کربوهیدرات قابل تخمیر است.
• بنفش بروموکرزول و قرمز کرزول نشانگرهای pH هستند که در شرایط اسیدی یا قلیایی تغییر رنگ می دهند. آنها به تشخیص تخمیر گلوکز و دکربوکسیلاسیون اسید آمینه کمک می کنند.
• پیریدوکسال کوفاکتور دکربوکسیلاز است.
• برای ترویج تخمیر، دکربوکسیلاسیون یا دی هیدرولاسیون فرآیندهای بی هوازی هستند. بنابراین، هر لوله با روغن های معدنی استریل پوشانده می شود تا از محیط در برابر اکسیژن محافظت کند.
• تلقیح محیط با یک باکتری که می تواند گلوکز را تخمیر کند، اسید تولید می کند که منجر به افت pH می شود. نشانگر pH نیز رنگ محیط را به زرد تغییر می دهد.
• نشانگر pH به دلیل تشکیل آمین از زرد به بنفش تغییر می کند (نتیجه افزایش pH).
• اگر ارگانیسمی که مورد آزمایش آمینو اسید دکربوکسیلاز قرار می گیرد، گلوکز را تخمیر کند اما دکربوکسیلاز را تخمیر نکند، محیط زرد یا اسیدی باقی می ماند.

اساس آزمایش لیزین و اورنیتین دکربوکسیلاز

اساس آزمایش آرژنین دکربوکسیلاز

روش انجام آزمایش آمینو اسید دکربوکسیلاز:

در اینجا روش انجام آزمایش آمینو اسید دکربوکسیلاز توضیح داده شده است:

آماده سازی محیط آزمایش:

• بسته به اسید آمینه ای که می خواهید آزمایش کنید (مثلاً لیزین، آرژنین، اورنیتین)، یک محیط مناسب براث دکربوکسیلاز، مانند براث مولر دکربوکسیلاز یا براث اوره کریستنسن انتخاب کنید.
• محیط را طبق دستورالعمل سازنده آماده کنید. معمولاً شامل حل کردن پودر متوسط در آب مقطر و اتوکلاو برای استریل کردن است.

تلقیح محیط آزمایش:

• یک سوسپانسیون بسیار غلیظ (برابر یا بیش از استاندارد کدورت شماره 0/5 مک فارلند) از باکتری­های جوان (18 تا 24 ساعته) رشد کرده بر روی آگار خون گوسفند 5 درصد تهیه کنید.
• با استفاده از یک حلقه (لوپ) یا سوزن استریل (انس)، یک کشت خالص از باکتری مورد آزمایش در محیط دکربوکسیلاز براث مورد نظر تلقیح می شود.
• به هر لوله یک لایه حداقل دو میلی متری از روغن معدنی استریل اضافه کنید. محیط ممکن است در اثر قرار گرفتن در معرض هوا قلیایی شود که نتیجه آن مثبت کاذب است.
• حتماً تلقیح را به صورت آسپتیک منتقل کنید تا از آلودگی جلوگیری شود.

انکوباسیون:

• لوله های براث دکربوکسیلاز تلقیح شده را در دمای مناسب، معمولاً 35 تا 37 درجه سانتیگراد، برای یک دوره مشخص، معمولاً 24 تا 48 ساعت انکوبه کنید.
• زمان انکوباسیون ممکن است بسته به باکتری خاص مورد آزمایش متفاوت باشد. لوله ها را در ساعت های 24، 48، 72 و 96 بررسی کنید.
• پس از 4 روز تلقیح، قرائت نهایی باید انجام شود.
• برخی از میکروارگانیسم ها ممکن است به افزایش زمان نهفتگی تا 10 روز نیاز داشته باشند.

مشاهده نتایج:

• پس از انکوباسیون، لوله ها را از نظر هرگونه تغییر قابل مشاهده در محیط به دقت بررسی کنید.
• با بررسی تولید گاز شروع کنید، که ممکن است با وجود حباب ها یا لوله های دورهمی پر از گاز مشخص شود (لوله های معکوس کوچکی که در محیط قرار می گیرند تا گاز را به دام بیندازند).
• سپس تغییر رنگ نشانگر pH را در محیط ارزیابی کنید.

تفسیر نتایج:

• تولید گاز: وجود گازی مانند دی اکسید کربن (CO2) در لوله دورهام نشان دهنده یک نتیجه مثبت برای فعالیت دکربوکسیلاز است.
• تغییر رنگ نشانگر pH: تغییر رنگ در نشانگر PH محیط نشان دهنده دکربوکسیلاسیون اسید آمینه خاص مورد آزمایش است.
• به عنوان مثال، دکربوکسیلاسیون لیزین منجر به تولید کاداورین می شود که باعث افزایش PH و تغییر رنگ نشانگر از زرد به بنفش می شود.
• به طور مشابه، دکربوکسیلاسیون آرژنین، آگماتین تولید می کند و در نتیجه رنگ آن از زرد به قرمز تیره یا بنفش تغییر می کند.

1. آزمایش آمینو اسید دکربوکسیلاز منفی: اگر رنگ محیط تغییر نکند به این معنی است که ارگانیسم گلوکز را تخمیر نمی کند.
2. آزمایش آمینو اسید دکربوکسیلاز منفی: محیطی که به رنگ زرد تغییر می کند نشان می دهد که گلوکز تخمیر شده دارد. با این حال، ارگانیسم دکربوکسیلاز مثبت برای این اسید آمینه نیست. ظاهر آبگوشت زرد نشان دهنده تخمیر گلوکز است، اما نشان دهنده دکربوکسیلاسیون نیست.
3. آزمایش آمینو اسید دکربوکسیلاز مثبت: رنگ بنفش نشان می دهد که محیط دکربوکسیله شده و آمین ها (محصولات جانبی قلیایی) تشکیل شده است. این نشانه آن است که ارگانیسم (+) برای اسید آمینه است. اگر محیط به رنگ بنفش در نیاید، به این معنی است که اسید آمینه هنوز دکربوکسیله نشده است. ارگانیسم همچنین آنزیم دکربوکسیلاز تولید نکرد.

لوله های کنترل:

• گنجاندن لوله های کنترل در آزمایش برای اطمینان از صحت نتایج ضروری است.
• یک لوله کنترل مثبت، حاوی یک سویه شناخته شده دکربوکسیلاز مثبت، باید تغییر رنگ و تولید گاز مورد انتظار را ایجاد کند.
• یک لوله کنترل منفی، حاوی یک سویه شناخته شده دکربوکسیلاز منفی، نباید تغییر رنگ یا تولید گاز نشان دهد.

توجه به این نکته مهم است که روش‌شناسی و تغییرات خاص آزمایش آمینو اسید دکربوکسیلاز ممکن است بسته به آزمایشگاه یا باکتری خاص مورد آزمایش متفاوت باشد. بنابراین، توصیه می‌شود هنگام انجام این آزمایش از پروتکل‌های تعیین‌شده پیروی کنید و از مراجع مناسب برای دستورالعمل‌های دقیق استفاده کنید.

محدودیت های آزمایش آمینو اسید دکربوکسیلاز:

•  تفسیر آزمایش باید در عرض 18 تا 24 ساعت انجام شود. جوجه کشی به مدت 10-12 ساعت برای شروع تخمیر گلوکز کافی است. محیط اسیدی که تخمیر ایجاد می کند منجر به تشکیل رنگ زرد می شود. هنگامی که محیط اسیدی ایجاد شد، آنزیم های دکربوکسیلاز نمی توانند تولید شوند.
• قبل از اینکه واکنش را تفسیر کنید، اگر دو لایه رنگ ظاهر شد، لوله را به آرامی تکان دهید.
• میکروارگانیسم‌های غیر تخمیرکننده گلوکز ممکن است فعالیت دکربوکسیلاز ضعیفی را نشان دهند، در نتیجه باعث تولید ناکافی آمین‌های لازم برای تبدیل سیستم نشانگر pH می‌شود. با این حال، برخی از تخمیرکننده‌ها به اندازه‌ای آمین تولید می‌کنند که رنگ بنفش محیط پایه عمیق‌تر از آن در یک لوله تلقیح نشده باشد.
• رنگ خاکستری می تواند نشان دهنده کاهش شاخص به جای تولید قلیایی باشد. بروموکرزول بنفش می تواند برای کمک به تفسیر واکنش استفاده شود.
• این آزمایش مقدار آنزیم داخل سلولی را اندازه گیری نمی کند و تنها زمانی آن را تشخیص می دهد که برای ایجاد تغییر pH در محیط کافی باشد.
• تغییر شرایط رشد (به عنوان مثال، غلظت گلوکز، لیزین و اسیدهای آمینه غیر از لیزین) ممکن است بر فعالیت لیزین دکربوکسیلاز تأثیر بگذارد.
• تخمیر دکستروز در محیط باعث تغییر رنگ اسید می شود. با این حال، تغییر رنگ قلیایی ناشی از واکنش دکربوکسیلاسیون مثبت را پنهان نمی کند.

برنامه کنترل کیفی (QC)  آزمایش آمینو اسید دکربوکسیلاز:

مثبت:

• لیزین (ATCC33495)
• اورنیتین انتروباکترآئروژینواز (ATCC13047)
• آرژینین انتروباکتر کلواکه (ATCC13047)

منفی:

• لیزین انتروباکتر کلواکه (ATCC13047)
• اورنیتین کلبسیلا پنومونیه (ATCC33495)
• آرژینین کلبسیلا پنومونیه (ATCC33495)
• پایه کلبسیلا پنومونیه (ATCC33495)

در سایت Microbiology Info در مورد آزمایش آمینو اسید دکربوکسیلاز بیشتر بخوانید:

اسیدهای آمینه به طور متغیر توسط باکتری های هوازی گرم منفی و بی هوازی اختیاری و همچنین کوکسی های گرم مثبت متابولیزه می شوند. این اسیدهای آمینه بسته به ارگانیسم و اسید آمینه مورد نظر دکربوکسیله، هیدرولیز یا دآمینه می شوند. در دکربوکسیلاسیون، آنزیم ها پیوند نگهدارنده گروه کربوکسیلیک (-COOH) را به بقیه اسید آمینه می شکنند.