آزمایش هورمون آدرنوکورتیکوتروپیک (ACTH) | کورتیکوتروپین | Adrenocorticotropic Hormone | corticotropin

روش رادیوایمونواسی (RIA):

RIA روشی است که از مواد رادیواکتیو برای اندازه گیری سطح ACTH در پلاسما استفاده می کند. مقدار مشخصی از ACTH رادیواکتیو به نمونه پلاسما اضافه می شود و آنتی بادی که به طور خاص به ACTH متصل می شود اضافه می شود. سپس مقدار رادیواکتیویته متصل به آنتی بادی اندازه گیری می شود که با مقدار ACTH در نمونه نسبت مستقیم دارد.

روش رادیوایمونواسی (RIA)

روش ایمونوسوربنت مرتبط با آنزیم (ELISA):

روش ایمونوسوربنت مرتبط با آنزیم (ELISA) یک روش پرکاربرد برای اندازه گیری سطوح هورمون آدرنوکورتیکوتروپیک (ACTH) در پلاسما است. روش انجام ELISA برای آزمایش ACTH روی پلاسما شامل چندین مرحله است:

• • آماده سازی: اولین مرحله آماده سازی نمونه های پلاسما برای تجزیه و تحلیل است. پلاسما معمولاً با سانتریفیوژ از سلول های خونی جدا می شود
  • پوشش دهی صفحه: در این مرحله پلیت میکروتیتر با آنتی بادی که به طور اختصاصی به ACTH متصل می شود پوشانده می شود. سپس پلیت برای مدتی انکوبه می شود تا آنتی بادی به سطح صفحه متصل شود.
  • مسدود کردن: پس از اینکه پلیت با آنتی بادی پوشانده شد، شسته می شود تا هر گونه آنتی بادی متصل نشده از بین برود و سپس با محلول مسدود کننده درمان می شود تا از هرگونه اتصال غیر اختصاصی جلوگیری شود.
  • افزودن استانداردها و نمونه ها: مجموعه ای از محلول های استاندارد حاوی غلظت های شناخته شده ACTH به همراه نمونه های پلاسمایی که قرار است آنالیز شوند به چاهک ها اضافه می شود.
  • انکوباسیون: پلیت برای مدتی انکوبه می شود تا ACTH موجود در استانداردها و نمونه ها به آنتی بادی پوشش داده شده متصل شود.
  • افزودن آنتی بادی تشخیص: پس از دوره انکوباسیون، یک آنتی بادی تشخیص که به طور خاص به ACTH نیز متصل می شود به پلیت اضافه می شود. این آنتی بادی معمولاً با آنزیمی مانند پراکسیداز ترب کوهی (HRP) یا آلکالین فسفاتاز (AP) نشاندار می شود.
  • انکوباسیون: پلیت دوباره انکوبه می شود تا آنتی بادی شناسایی به هر ACTH که به آنتی بادی پوشش داده شده متصل است متصل شود.
  • افزودن سوبسترا: پس از دوره انکوباسیون، یک محلول سوبسترا به چاهک اضافه می شود که با برچسب آنزیم روی آنتی بادی تشخیص واکنش می دهد و یک سیگنال رنگی یا فلورسنت تولید می کند.
  • اندازه گیری: سپس رنگ یا شدت فلورسانس با استفاده از الایزا ریدر اندازه گیری می شود و غلظت ACTH در نمونه های پلاسما با مقایسه با محلول های استاندارد تعیین می شود.

ELISA برای آزمایش ACTH یک روش حساس و اختصاصی برای اندازه‌گیری سطوح ACTH در پلاسما است، با محدوده تشخیص معمولاً 5 تا 2000 پیکوگرم در میلی لیتر.

روش طیف سنجی جرمی (MS):

روش طیف سنجی جرمی (MS) یک تکنیک تحلیلی قدرتمند است که می تواند برای اندازه گیری سطوح هورمون آدرنوکورتیکوتروپیک (ACTH) در پلاسما استفاده شود. روش MS شامل جداسازی و تشخیص تک تک مولکول ها بر اساس نسبت جرم به بار آنها است.

روش انجام آزمایش MS برای ACTH روی پلاسما شامل مراحل زیر است:

• آماده سازی نمونه: اولین مرحله آماده سازی نمونه های پلاسما برای تجزیه و تحلیل است. پلاسما معمولاً با سانتریفیوژ از سلول های خونی جدا می شود و سپس در دمای 20- درجه سانتی گراد نگهداری می شود تا آنالیز انجام شود. سپس نمونه ها با استفاده از روشی مناسب برای جداسازی مولکول ACTH استخراج می شوند (مانند استخراج فاز جامد (SPE)، استخراج مایع-مایع (LLE)، یا رسوب پروتئین)
• جداسازی: نمونه های استخراج شده با استفاده از کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا (HPLC) یا سایر روش های کروماتوگرافی جدا می شوند. این امر تک تک مولکول های موجود در نمونه از جمله مولکول ACTH را جدا می کند.
• یونیزاسیون: سپس مولکول های جدا شده یونیزه می شوند، به این معنی که بار الکتریکی به آنها داده می شود و آنها را برای تجزیه و تحلیل جرم مناسب می کند. این کار معمولاً با استفاده از یونیزاسیون الکترواسپری (ESI) یا دفع/یونیزاسیون لیزری به کمک ماتریس (MALDI) انجام می شود.
• تجزیه و تحلیل جرم: سپس مولکول های یونیزه شده بر اساس نسبت جرم به بار با استفاده از طیف سنج جرمی جدا می شوند. یون ها شناسایی می شوند و داده ها برای تعیین میزان ACTH در نمونه تجزیه و تحلیل می شوند.

مکانیسم روش LC MS

MS برای آزمایش ACTH یک روش بسیار حساس و اختصاصی است، با محدوده تشخیص معمولاً 0.5 تا 50 پیکوگرم در میلی لیتر. روش MS می تواند ایزوفرم های خاص ACTH و سایر پپتیدهای مرتبط را شناسایی کند و اطلاعات تشخیصی بیشتری را ارائه دهد. با این حال، روش MS نیاز به تجهیزات و تخصص تخصصی دارد و نسبت به روش‌های دیگر مانند ELISA یا CLIA زمان‌برتر است. MS عمدتاً در محیط های تحقیقاتی یا برای اهداف تشخیصی زمانی که سایر روش ها در ارائه تشخیص قطعی شکست خورده اند، استفاده می شود.

روش ایمونورادیومتری 2 سایتی (IRMA):

این روش بسیار حساس و اختصاصی برای اندازه گیری سطوح هورمون آدرنوکورتیکوتروپیک (ACTH) در پلاسما است. روش IRMA شامل استفاده از دو آنتی بادی است که یکی از آنها با یک ایزوتوپ رادیواکتیو نشاندار شده است تا سطح ACTH در نمونه را شناسایی و کمی کند.

روش انجام روش IRMA برای اندازه گیری ACTH پلاسما شامل مراحل زیر است:

• آماده سازی نمونه: اولین مرحله آماده سازی نمونه های پلاسما برای تجزیه و تحلیل است. پلاسما معمولاً با سانتریفیوژ از سلول های خونی جدا می شود و سپس در دمای 20- درجه سانتی گراد نگهداری می شود تا تجزیه و تحلیل انجام شود.
• تهیه آنتی بادی: دو آنتی بادی مورد استفاده در روش IRMA به طور جداگانه تهیه می شوند. یک آنتی بادی مخصوص قسمت N ترمینال مولکول ACTH است، در حالی که آنتی بادی دیگر مخصوص قسمت C ترمینال است. آنتی بادی N ترمینال با یک ایزوتوپ رادیواکتیو، به طور معمول ید-125 نشاندار شده است.
• انکوباسیون: نمونه پلاسمای استخراج شده سپس با هر دو آنتی بادی انکوبه می شود و به دو آنتی بادی اجازه می دهد تا در صورت وجود در نمونه به مولکول ACTH متصل شوند. آنتی بادی N ترمینال به عنوان یک آنتی بادی جذب عمل می کند، در حالی که آنتی بادی ترمینال C به عنوان یک آنتی بادی تشخیص عمل می کند.
• جداسازی: سپس مولکول ACTH متصل به آنتی بادی با استفاده از روش جداسازی فاز جامد، مانند سانتریفیوژ یا فیلتراسیون، از آنتی بادی های غیر متصل جدا می شود.
• اندازه گیری رادیواکتیویته: مقدار رادیواکتیویته مرتبط با مولکول ACTH گرفته شده سپس با استفاده از یک شمارنده گاما اندازه گیری می شود که اندازه گیری کمی از مقدار ACTH در نمونه را ارائه می دهد.

روش IRMA برای ACTH بسیار اختصاصی است و می تواند سطوح پایین را تا یک pg/mL اندازه گیری کند. این روش همچنین بسیار قابل تکرار است و نشان داده شده است که نتایج دقیق و دقیقی را ارائه می دهد. با این حال، روش IRMA به تجهیزات تخصصی نیاز دارد و نسبت به روش‌های دیگر مانند ELISA یا FIA زمان‌بر و گران‌تر است. در نتیجه، روش IRMA معمولاً فقط برای اهداف تحقیقاتی یا در آزمایشگاه‌های تخصصی استفاده می‌شود.

در حال حاضر، روش ارجح برای اندازه گیری هورمون آدرنوکورتیکوتروپیک (ACTH) در پلاسما، ایمونواسی الکترو کمی لومینسانس (ECL) است. ایمونواسی ECL حساسیت و ویژگی بالا را همراه با دامنه دینامیکی گسترده ارائه می دهد که آن را برای اهداف تحقیقاتی و بالینی مناسب می کند.

روش مرجع برای اندازه گیری ACTH، سنجش ایمونورادیومتریک 2 سایتی (IRMA) است که توسط سازمان های بین المللی مانند فدراسیون بین المللی شیمی بالینی و پزشکی آزمایشگاهی (IFCC) و سازمان بهداشت جهانی (WHO) تایید و استاندارد شده است. با این حال، به دلیل استفاده از ایزوتوپ‌های رادیواکتیو، IRMA به اندازه گذشته مورد استفاده قرار نمی‌گیرد و روش‌های جایگزین مانند ایمونواسی ECL محبوب‌تر می‌شوند.

روش‌های رادیوایمونواسی (RIA) و روش‌های ایمونوسوربنت متصل به آنزیم (ELISA) نیز معمولاً برای اندازه‌گیری ACTH در پلاسما استفاده می‌شوند. RIA زمانی استاندارد طلایی برای اندازه گیری ACTH بود اما تا حد زیادی با روش پیشرفته تر IRMA جایگزین شده است. ELISA یک روش ایمونواسی پر استفاده است که حساسیت و ویژگی بالایی را ارائه می دهد، اگرچه ممکن است نسبت به روش های دیگر مانند ایمونواسی ECL حساسیت کمتری داشته باشد.

طیف سنجی جرمی (MS) یک روش جدیدتر برای اندازه گیری ACTH در پلاسما است که ویژگی و دقت بالایی را ارائه می دهد. با این حال، MS پیچیده‌تر و گران‌تر از روش‌های دیگر است و معمولاً برای اهداف تحقیقاتی یا آزمایشگاه‌های تخصصی اختصاص داده می‌شود.

آمادگی قبل از انجام آزمایش هورمون آدرنوکورتیکوتروپیک (ACTH):

• 24 ساعت قبل از جمع آوری نمونه از مولتی ویتامین ها یا مکمل های غذایی حاوی بیوتین (ویتامین B7) که معمولا در مکمل ها و مولتی ویتامین های مو، پوست و ناخن یافت می شود، استفاده نکنید.
• بیمار را از نظر عوامل استرسی که می تواند نتایج آزمایش را مختل کند، ارزیابی کنید. جمع آوری استرس زا از خون سطح را افزایش می دهد.
• بیمار را از نظر اختلالات الگوی خواب ارزیابی کنید. با یک الگوی خواب طبیعی، سطح ACTH بین ساعت 4 صبح تا 8 صبح بالاترین سطح و در حدود ساعت 9 شب کمترین میزان است.
• برای جلوگیری از تخریب آنزیمی ACTH، لوله خون را سرد کنید.
• برای تشخیص سندرم کوشینگ، نمونه برداری باید بین ساعت 6 تا 11 شب انجام شود.
•  چاقی می تواند مقدار را افزایش دهد.
• 10 تا 12 ساعت قبل از نمونه برداری از فعالیت بدنی خودداری کنید. فعالیت بدنی مقدار را افزایش می دهد.
• از بیمار بخواهید که بعد از نیمه شب، شب قبل از نمونه برداری چیزی نخورد یا ننوشد.
• 48 ساعت قبل از انجام این آزمایش، مصرف داروهایی مانند کورتیکواستروئیدها را قطع کنید.

چه چیزی در آزمایش هورمون آدرنوکورتیکوتروپیک (ACTH) مورد بررسی قرار می گیرد؟

هورمون آدرنوکورتیکوتروپیک (ACTH) هورمونی است که در غده هیپوفیز (که در زیر مغز در داخل جمجمه قرار دارد) تولید می شود تا ترشح هورمون کورتیزول توسط غدد فوق کلیوی ( اندام های کوچک موجود در بالای هر کلیه) را تحریک کند. استرس می تواند ترشح آدرنوکورتیکوتروپیک (ACTH) را تحریک کند.

کورتیزول برای تنظیم متابولیسم گلوکز، پروتئین و چربی، سرکوب پاسخ ایمنی و حفظ فشار خون مهم است. به طور معمول، غلظت آدرنوکورتیکوتروپیک (ACTH) زمانی که کورتیزول کم است افزایش می یابد و زمانی که کورتیزول بالا است کاهش می یابد.

نحوه عملکرد ACTH

یک مکانیسم بازخورد پیچیده برای کورتیزول، عملکرد هیپوتالاموس، غده هیپوفیز و غدد فوق کلیوی را هماهنگ می کند. هورمون آدرنوکورتیکوتروپیک (ACTH) یک جنبه مهم از این مکانیسم است.

هورمون آزاد کننده کورتیکوتروپین (CRH) در هیپوتالاموس ساخته می شود، و باعث شروع متابولیسم ACTH با سنتز و ترشح آن توسط غده هیپوفیز قدامی آغاز می شود. ACTH از یک پروتئین پیش ساز بزرگتر به نام پروپیوملانوکورتین (POMC) تولید می شود که همچنین پیش ساز سایر هورمون ها مانند بتا اندورفین و هورمون محرک ملانوسیت (MSH) است. POMC توسط آنزیم های پروتئولیتیک برای تولید ACTH شکسته می شود که سپس در پاسخ به استرس وارد جریان خون می شود.

ACTH روی قشر آدرنال، که لایه بیرونی غده فوق کلیوی است، عمل می کند. به طور خاص، به گیرنده های روی سطح سلول ها در ناحیه زونا فاسیکولاتا و زونا رتیکولاریس قشر آدرنال، که مسئول تولید گلوکوکورتیکوئیدهایی مانند کورتیزول هستند، متصل می شود. اتصال ACTH به گیرنده آن باعث تحریک یک سری واکنش های بیوشیمیایی می شود که در نهایت منجر به تولید و ترشح کورتیزول می شود.

نحوه عمل ACTH پیچیده است و شامل چندین مسیر مختلف است. یکی از مسیرهای کلیدی فعال شدن مسیر سیگنالینگ cAMP (آدنوزین مونوفسفات حلقوی) است. هنگامی که ACTH به گیرنده خود در سلول های قشر آدرنال متصل می شود، گیرنده جفت شده با پروتئین G را فعال می کند که تولید cAMP را تحریک می کند. سپس cAMP یک سری آنزیم های پایین دستی را فعال می کند که در نهایت منجر به تولید کورتیزول می شود.

ACTH همچنین در تنظیم سنتز کلسترول، که پیش ساز تولید کورتیزول است، نقش دارد. جذب کلسترول لیپوپروتئین با چگالی کم (LDL) توسط سلول های قشر آدرنال را تحریک می کند، که سپس به پرگننولون، یک مولکول پیش ساز برای سنتز کورتیزول، تبدیل می شود.

اثرات ACTH

در بیمار مبتلا به سندرم کوشینگ، افزایش سطح آدرنوکورتیکوتروپیک (ACTH) می تواند ناشی از یک تومور مولد ACTH هیپوفیز یا یک تومور تولید کننده ACTH غیر هیپوفیز (اکتوپیک)، معمولا در ریه، پانکراس، تیموس یا تخمدان باشد. سطوح آدرنوکورتیکوتروپیک (ACTH) بیشتر از 200 پیکوگرم در میلی لیتر معمولاً نشان دهنده تولید آدرنوکورتیکوتروپیک (ACTH) خارج از هیپوفیز (اکتوپیک) است. اگر سطح ACTH در یک بیمار مبتلا به سندرم کوشینگ کمتر از حد طبیعی باشد، احتمالاً آدنوم یا کارسینوم آدرنال علت عملکرد بیش از حد است.

در بیماران مبتلا به بیماری آدیسون، افزایش سطح آدرنوکورتیکوتروپیک (ACTH) نشان دهنده نارسایی اولیه غده آدرنال است، مانند تخریب غده آدرنال ناشی از انفارکتوس، خونریزی یا خودایمنی. برداشتن غده فوق کلیوی با جراحی؛ کمبود آنزیم مادرزادی؛ یا سرکوب آدرنال در اثر مصرف طولانی مدت استروئیدهای اگزوژن. اگر سطح آدرنوکورتیکوتروپیک (ACTH) در بیمار مبتلا به نارسایی آدرنال کمتر از حد طبیعی باشد، به احتمال زیاد هیپوفیتاریسم علت کم کاری است.

سطوح آدرنوکورتیکوتروپیک (ACTH) تغییرات روزانه را نشان می دهد که با سطح کورتیزول مطابقت دارد. سطوح نمونه های عصر (8 شب تا 10 شب) معمولاً یک دوم تا دو سوم نمونه های صبح (4 صبح تا 8 صبح) است. زمانی که بیماری (به ویژه نئوپلاسم) بر غدد هیپوفیز یا آدرنال تأثیر بگذارد، تغییرات روزانه وی از بین می رود. به همین ترتیب استرس می تواند این تغییرات طبیعی روزانه را کمرنگ یا از بین ببرد.

هنگامی که جنین مشکوک به آنسفالی باشد، هورمون آدرنوکورتیکوتروپیک (ACTH) در مایع آمنیوتیک اندازه گیری می شود. کاهش سطوح در جنین های آنسفالیک مشاهده می شود.